[发明专利]一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用

权利要求书

1.一种合成西他列汀的双菌生物催化剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得；

枯草芽孢杆菌的菌株为Bacillus subtili168，表达质粒为pHT43或pHT01；

巨大芽孢杆菌的菌株为Bacillus megateriumATCC14581模式菌株；

所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：

(1)将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQ IDNO：2-3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；

(2)采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含的LB抗性平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant-01；

(3)将表达生物酶的Recombinant-01，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD₆₀₀在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导22h；发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得枯草芽孢杆菌全细胞催化剂。

2.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：将Bacillus megateriumATCC14581模式菌株接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得巨大芽孢杆菌全细胞催化剂。

3.权利要求1或2所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为化合物I，即西他列汀，其反应路线为，

4.根据权利要求3所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述助溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸丁酯、DMSO中的任一种。

5.根据权利要求4所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述助溶剂为DMSO；所述缓冲液为0.1～2M、pH值为8.0～8.5的三乙醇胺盐酸盐。

6.根据权利要求3所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述化合物II和双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的质量比为1:1～30；

所述化合物II与所述氨基供体的质量比为1:1～10；

所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～100；

催化反应时的反应温度为0～60℃。

7.根据权利要求6所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述化合物II和双菌生物催化剂中的巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的质量比为1:1～20；

所述化合物II与所述氨基供体的质量比为1:1～5；

所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～10；

双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂与辅酶PLP的质量比5～30:1；

催化反应时的反应温度为30～45℃。