[发明专利]一种重组蛋白、重组表达载体、重组细胞和NK细胞激活磁珠及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组蛋白、重组表达载体、重组细胞和NK细胞激活磁珠及其制备方法和应用，涉及NK细胞激活扩繁技术领域。本发明将单链抗体和Streptag2标签进行融合，结构简单，使得重组表达载体或重组细胞表达出的抗体，无需进行生物素化修饰就可直接与磁珠进行组装，且组装后的磁珠可以直接作为NK细胞的扩增刺激物，可以有效的扩增NK细胞。本发明所述NK细胞激活磁珠的结合能力高达97％以上，二者的特异性高；利用所述NK细胞激活磁珠激活培养得到NK细胞系与滋养细胞法激活培养的NK细胞的杀伤效率无明显区别。

技术领域

本发明属于NK细胞激活扩繁技术领域，具体涉及一种重组蛋白、重组表达载体、重组细胞和NK细胞激活磁珠及其制备方法和应用。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是一种无需抗原刺激或预先致敏就能自发杀死肿瘤细胞的固有淋巴细胞，在抗病毒和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。其免疫表型特征主要为CD3^-CD56⁺，是一种不表达T细胞受体，也不表达B细胞受体的淋巴细胞亚群。NK细胞可以通过多种途径杀死肿瘤细胞或病毒感染细胞，包括直接细胞毒性(自然细胞毒性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和间接效应(如细胞因子产生和与适应性免疫相互作用)。NK细胞由于其广谱性和高杀伤力，具有很高的应用前景，有希望成为一种治疗肿瘤的过继性免疫治疗新策略，因此，开发一种在体外高效稳定扩增NK细胞的方法是非常必要的。

NK细胞约占血液中淋巴细胞的5-10％，而在细胞疗法中充足的细胞数量和细胞纯度是NK细胞杀伤肿瘤细胞作用的重要因素，但NK细胞的增殖很弱，无法提供充足数量的细胞进行给药，远不能满足临床需要，从而使得依赖于NK细胞的治疗方案大多都处于早期研发阶段，这成为将其应用于临床的最大的问题。目前，NK细胞体外激活效率最高的方法是通过添加灭活K562滋养层细胞的滋养细胞法，经过2-3周培养后NK细胞的阳性率可高达90％以上，但是灭活的滋养层细胞难以去除，且很难做到治疗级别。近两年，市面上也出现了一些重组细胞因子的培养方案，大部分能稳定的做到40-50％左右的阳性率，但是培养过程中会有大量T细胞增殖，且影响后续的使用效果，并可能带来急性移植物抗宿主病(GVHD)的风险，而做到80％以上阳性率的方案，或扩增效率一般，或个体差异严重。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组蛋白、重组表达载体、重组细胞和NK细胞激活磁珠及其制备方法和应用，所述重组蛋白或利用重组表达载体、重组细胞获得的抗体可直接与磁珠进行组装，且组装后的磁珠可以直接作为NK细胞的扩增刺激物，可以有效的扩增NK细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白的结构包括单链抗体NM₃E₂和Streptag2。

优选的，在所述单链抗体NM₃E₂的N端连接IL21信号肽，C端连接IgG1，形成IL21-NM₃E₂-IgG1，所述IL21-NM₃E₂-IgG1的编码基因包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

优选的，所述IL21信号肽的编码基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；单链抗体NM₃E₂的编码基因包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

优选的，所述Streptag2的编码基因包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达上述重组蛋白的重组表达载体，所述重组表达载体的基础载体包括真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc。