[发明专利]一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT-LAMP可视化检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的快速一步法RT‑LAMP可视化检测试剂盒，属于动物虫媒病毒检测技术领域。该试剂盒包括引物组、显色物质和反应试剂组、阳性对照和阴性对照；所述引物组包括用于检测TIBOV的特异性RT‑LAMP引物组、用于检测BAV的特异性RT‑LAMP引物组和用于检测MSV的特异性RT‑LAMP引物组；所述阳性对照为TIBOV、BAV和MSV的重组质粒；阴性对照为DEPC处理ddH₂O。通过本发明试剂盒的RT‑LAMP方法能够快速诊断样品中携带的TIBOV、BAV或MSV，设备简单，操作简便，灵敏度高和特异性强，适用现场诊断，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及动物虫媒病毒检测技术领域，具体涉及一种快速灵敏的西藏环状病毒、版纳病毒和芒市病毒的RT-LAMP可视化试剂盒。

背景技术

虫媒病毒(Arbovirus)广泛分布于热带、亚热带与温带地区，病毒主要通过吸血节肢动物(主要为蠓、蜱、蚊、白蛉等)叮咬传播，可感染人、反刍动物、马属动物、有袋目哺乳动物、蝙蝠以及鸟类等多种动物并引发相关疾病，给家畜的养殖以及人类的公共卫生安全带来严重的威胁，目前已发现100余种虫媒病毒可引起人、畜或人畜共患疾病，主要集中有披膜病毒科、黄病毒科、布尼亚病毒科和呼肠孤病毒科等。迄今，虫媒病毒仍然在世界各地引发严重传染病，特别是近年来随着全球气候变暖和经济一体化进程加快，致使虫媒病毒病流行范围更广和危害更大，给世界各国造成了巨大的经济损失，并加重了公共卫生负担。

西藏环状病毒(Tibet Orbivirus，TIBOV)隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)。2009年首次从我国西藏墨脱县采集的蚊虫标本中分离出，随后在广东省、湖南省采集的蚊虫标本和在云南省芒市、西双版纳州和师宗县采集的库蠓样本中分离出。在云南省师宗、德宏、景洪等多个地区采集到的牛、羊和猪的血清样本中均检测到TIBOV的中和抗体，特别是多地牛血清的抗体阳性率高于20％，同时有文献报道TIBOV是家畜动物不明原因发热甚至流产的潜在致病病原。以上研究表明TIBOV在我国多地已经存在，可感染多种家畜，是一种潜在致病性病原，对我国牛羊养殖业构成了潜在威胁。

版纳病毒(Banna virus，BAV)隶属呼肠孤病毒科(Reoviridae)东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)，为东南亚十二节段RNA病毒属的代表株，于1987年首次从我国西双版纳地区无名热和脑炎患者采集的脑脊液及血清标本中分离出。此后又陆续从印度尼西亚、越南、老挝等东南亚国家和中国甘肃、山西、山东、辽宁、内蒙古、湖北等地区采集的蚊虫或库蠓标本中分离出。并且多次直接从病人标本中分离到BAV，并在不明原因发热和病毒性脑炎患者血清中筛查到BAV的IgM和IgG抗体，这些研究结果表明了BAV可能是一种引起人类发热和病毒性脑炎的重要新发传染病的病原体，引起了国内外病毒学家和疾病预防控制专家的广泛关注。

芒市病毒(Mangshi virus,MSV)隶属呼肠病毒科(Reoviridae)东南亚十二节段RNA病毒属(Seadornavirus)，为一种新发现的虫媒病毒。病毒于2013年在云南省芒市采集的三带喙库蚊(C.tritaeniorhynchus)中首次分离并因而得名，2014年在我国广东省汕头市濠江区采集的三带喙库蚊中再次分离到MSV，并于2019年首次从云南省景洪市哨兵牛的血液中分离到了MSV。但作为新发虫媒病毒的MSV，感染宿主动物的范围、感染特征、对动物健康和公共卫生的危害尚不清楚。

目前，动物感染病毒的检测方法主要有血清抗体检测和核酸检测，血清检测主要进行ELISA实验，但ELISA检测耗时长(2-3小时)，操作复杂，属于感染后的晚期诊断，并不适合作为快速检测方法；核酸检测主要包括常规RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法；常规RT-PCR耗时长，灵敏度低，扩增结束后需电泳检测，易污染，很难在感染初期检出病毒；实时荧光定量RT-PCR虽然灵敏度和时效性上有所提高，但是需要昂贵的检测设备。