[发明专利]一种多器官细胞基因突变检测基因编辑小鼠模型的构建及应用

说明书

本发明提供一种CD59基因编辑小鼠模型，它是定点敲入CD59‑增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达序列片段的小鼠。本发明还提供构建CD59‑EGFP基因编辑小鼠模型的方法，是利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术在小鼠基因ROSA26位点定点敲入CD59‑EGFP基因序列的方法，包括：设计并获得向导RNA，制备向导RNA与Cas9蛋白混合物；构建CD59‑EGFP打靶载体；显微共注射与F0代小鼠获得，F1代小鼠获得；CD59‑EGFP打靶载体中，CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的基因编辑小鼠模型对致突变化学物有应答，分离其肝细胞、生殖细胞，在荧光显微镜下通过绿色荧光可以显示CD59胞膜定位，可用于化学物的多器官细胞致突变性检测。

技术领域

本发明涉及一种多器官细胞基因突变检测基因编辑小鼠模型，以及所述模型的构建方法及其应用，属于生物化学领域。

背景技术

CD59是一种分子量18～20kDa的膜性调节蛋白。CD59由103个氨基酸残基组成，含有单一的N端糖基化位点，其C端借糖化磷脂酰肌醇锚固定于细胞表面。CD59分布甚广泛，已证明皮肤、肝、肾、胰、肺、唾液腺、神经系统、胎盘以及各种血细胞(红细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及血小板)和精子上均有表达。在阵发性睡眠性血红蛋白尿症等贫血疾病中红细胞表达缺陷，临床上常用做该类疾病的生物标志物。已有研究提示致突变化学物可以导致外周血细胞表面CD59表达减少。

人CD59基因定位于第11号染色体短臂，与小鼠CD59有同源性。因此，构建一种导入荧光蛋白融合表达的CD59基因编辑小鼠，在荧光显微镜下直接观察细胞膜表面的荧光强度，方便快捷反映多种器官细胞的基因突变，具有其优势和应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种表达荧光蛋白融合CD59的基因编辑小鼠模型，应用于多器官细胞基因突变的检测。

本发明的另一个目的是提供构建所述基因编辑小鼠模型的方法。

本发明的再一个目的是提供所述基因编辑小鼠模型分离其肝细胞、生殖细胞，在不同器官、细胞类别(体细胞、生殖细胞)基因突变检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

首先，提供一种CD59基因编辑小鼠模型，它是定点敲入CD59-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达序列片段的小鼠。

本发明所述的CD59基因编辑小鼠模型对致突变化学物有应答。其外周血细胞、分离获得的肝细胞、生殖细胞，在荧光显微镜下可见绿色荧光分布于胞膜，给予小鼠致突变化学物，胞膜绿色荧光强度减弱。

本发明还提供一种构建CD59基因编辑小鼠模型的方法，是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在小鼠基因ROSA26位点定点敲入CD59-EGFP基因序列的方法，包括：设计并获得向导RNA，制备向导RNA与Cas9蛋白混合物；构建CD59-EGFP打靶载体；显微共注射与F0代小鼠获得，F1代小鼠获得。

本发明优选的所述构建方法中，所述的CD59-EGFP打靶载体，其中CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明最优选的所述构建方法，具体包括如下步骤：

1)设计并获得CD59-EGFP向导RNA；

2)将1)所得到的向导RNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/向导RNA混合物；

3)构建打靶载体，利用In-Fusion克隆技术构建CAG-Kozak-CD59-GS linker-EGFP-polyA同源重组载体，其中所述的CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；