[发明专利]一种多器官细胞基因突变检测基因编辑小鼠模型的构建及应用

权利要求书

1.一种CD59基因编辑小鼠模型，它是定点敲入CD59-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达序列片段的小鼠。

2.一种构建CD59-EGFP基因编辑小鼠模型的方法，是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在小鼠基因ROSA26位点定点敲入CD59-EGFP基因序列的方法，包括：设计并获得向导RNA，制备向导RNA与Cas9蛋白混合物；构建CD59-EGFP打靶载体；显微共注射与F0代小鼠获得，F1代小鼠获得；所述的CD59-EGFP打靶载体中，CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求2所述的构建CD59-EGFP基因编辑小鼠模型的方法，具体包括如下步骤：

1)设计并获得CD59-EGFP向导RNA；

2)将1)所得到的向导RNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/向导RNA混合物；

3)构建打靶载体，利用In-Fusion克隆技术构建CAG-Kozak-CD59-GS linker-EGFP-polyA同源重组载体，其中所述的CD59的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的EGFP核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

4)将2)得到的Cas9/向导RNA混合物和3)得到的打靶载体共注射到C57BL/6N小鼠受精卵的原核中，将注射后的所述受精卵移植入代孕母鼠中发育，出生后经基因型鉴定筛出中靶小鼠，即F0代小鼠；

5)将4)中获得的所述F0代小鼠中的性成熟小鼠与野生型C57BL/6N小鼠进行配繁得到F1代小鼠，经基因型鉴定从F1代小鼠中筛出转入了所述CD59-EGFP表达序列片段的杂合子小鼠，即得到可传代繁育的CD59-EGFP转基因小鼠。

4.权利要求2或3任意一项所述的构建CD59-EGFP基因编辑小鼠模型的方法，其特征在于，所述的向导RNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求3所述的构建CD59-EGFP基因编辑小鼠模型的方法，其特征在于，步骤4)和/或步骤5)所述的基因型鉴定的步骤包括：采用PCR检测或测序验证，提取小鼠尾基因组DNA，进行中靶后的PCR鉴定，引物序列如下：

6.权利要求5所述的构建CD59-EGFP基因编辑小鼠模型的方法，其特征在于，所述的PCR鉴定中，采用序列如下的PCR引物，获得较短片段PCR产物：

引物名称	引物序列
F4	5’-TCAAGATCCGCCACAACATCG-3’(SEQ ID NO.10)
R4	5’-CTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGC-3’(SEQ ID NO.11)

。