[发明专利]一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用

说明书

本发明公开了一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用。具体地公开了制备CD19‑CAR‑NK细胞的方法，利用靶向AAVS1位点的CRISPR/CAS9系统，将CD19‑CAR基因和EF1α启动子定向敲入人多能干细胞基因组AAVS1区，得到重组人多能干细胞(CD19‑CAR‑hPSC)，再诱导培养CD19‑CAR‑hPSC分化成拟胚体，从拟胚体分化的造血前体细胞中分选CD34⁺造血前体细胞，再向NK细胞定向分化，最终分化成CD19‑CAR‑NK细胞。本发明的CD19‑CAR‑NK细胞具有更高的增殖能力，纯度更高、具有更强的抗肿瘤能力，可以安全、有效的用于肿瘤免疫治疗。

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术是采用基因工程技术修饰免疫细胞，使其表达外源性抗肿瘤基因(CAR基因)，使得淋巴细胞等免疫细胞具有识别肿瘤细胞表面抗原的能力，并特异性识别和杀伤肿瘤细胞，没有组织相容复合体(MHC)的限制，CAR的结构主要由细胞外识别细胞表面抗原的结构域和细胞内信号转导结构域组成，细胞外的结构域用于特异性地识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)，细胞内的结构域含有共刺激分子结构域，用于在识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)后启动淋巴细胞的免疫应答，针对特异性的靶细胞发挥细胞毒性的作用，从而杀伤靶细胞(肿瘤细胞)。目前，CAR-T技术已经能够应用于临床医疗，并在全世界获得了诸多成功的临床案例，但Car-T细胞引发的细胞因子释放综合征(CRS)是目前该治疗方法最主要的一种不良反应，会引发急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭等严重后果，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。

自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)是天然免疫(innate immunity)系统的主力军，被认为是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线。NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结，是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节密切相关。NK细胞表面固有表达多种活化性和抑制性受体，起到保护自身组织并监视病变细胞的作用。依赖NK细胞固有表达受体的识别方式，没有MHC的限制，即可识别病变或恶性转化细胞，具有快速反应并杀伤病变细胞的功能，起到免疫监视的作用。T细胞同样具有直接杀伤功能，但需要抗原提呈细胞(APC)递呈抗原，还有MHC的限制。T细胞种类多、在体内扩增能力强，可产生长时间的免疫应答，但也有细胞因子风暴的风险。与T细胞相比，NK细胞在肿瘤免疫治疗上具有独特的优势：NK细胞亚群少，体内存活时间短，无细胞因子风暴等副作用，不可预期风险低；此外，由于免疫排斥机制，T细胞治疗目前多采用自体细胞，而已报道基于异体NK细胞的肿瘤免疫治疗均未见严重非可控移植物排斥宿主反应(Graft versus host reaction，GVHR)，因此可以将它们从供体提供给接受者，而无需进行匹配，表明异体NK细胞治疗的可行性，可以从一个供体中制备多个剂量的CAR-NK细胞来治疗多个患者，是天然“通用型”(即“一个来源”可适用于大量人群)的免疫细胞治疗的来源，更容易在临床上推广应用。