[发明专利]一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用

权利要求书

1.制备表达CAR的重组NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：使表达CD19-CAR基因的重组多能干细胞分化为自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞即为表达CAR的重组NK细胞；所述CD19-CAR是包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质；所述胞外结构域包括抗CD19的scFv，所述胞内结构域包括2B4的胞内区和DAP10的胞内区。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD19-CAR为下述任一种蛋白质：

P1、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区；

P2、所述CD19-CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和/或所述CD19-CAR还包括CD8铰链区，和/或所述CD19-CAR还包括信号肽；

P3、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19-CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19-CAR还包括CD8铰链区，和所述CD19-CAR还包括信号肽；

P4、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19-CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19-CAR还包括CD8铰链区。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

所述2B4的胞内区是如下任一种蛋白质：

C1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第333-446位的蛋白质；

C2)将SEQ ID No.2的第333-446位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

C3)在C1)或C2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

所述DAP10的胞内区是如下任一种蛋白质：

D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第447-470位的蛋白质；

D2)将SEQ ID No.2的第447-470位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

D3)在D1)或D2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

所述2B4的跨膜区是如下任一种蛋白质：

E1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第309-332位的蛋白质；

E2)将SEQ ID No.2的第309-332位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

E3)在E1)或E2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

所述CD3ζ是如下任一种蛋白质：

F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第471-582位的蛋白质；

F2)将SEQ ID No.2的第471-582位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有信号转导功能的蛋白质；

F3)在F1)或F2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有信号转导功能的融合蛋白质；

所述CD8铰链区是如下任一种蛋白质：

G1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第264-308位的蛋白质；

G2)将SEQ ID No.2的第264-308位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与G1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

G3)在G1)或G2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

所述抗CD19的scFv是如下任一种蛋白质：

H1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第22-263位的蛋白质；

H2)将SEQ ID No.2的第22-263位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

H3)在H1)或H2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

所述信号肽是如下任一种蛋白质：

I1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第1-21位的蛋白质；

I2)将SEQ ID No.2的第1-21位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与I1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

I3)在I1)或I2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。