[发明专利]一种检测生物分子数量的方法

说明书

本发明的一种检测生物分子数量的方法。该方法通过RCA扩增样品中的生物分子得到DNA纳米球，利用电化学方法对通过具有单一孔道的基层的DNA纳米球产生的电流进行检测，计算得到样品中扩增后的DNA纳米球的数量。本发明采用RCA扩增得到一定尺寸的DNA纳米球，建立一个尺寸与DNA纳米球相匹配的孔道，能够最终能利用库尔特技术读取DNA纳米球在过孔瞬间的电压脉冲信号，将实现待测生物分子的特异性识别，并实现对其数量的精确统计。

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种检测生物分子数量的方法。

背景技术

在人工配制溶液或细胞裂解液、组织液、血液等环境下，特异性识别特定的、痕量的核酸、蛋白质等生命物质并准确统计其数量，对重大疾病筛查，特别是疾病的早期筛查具有重大的意义。库尔特技术是一种成熟的颗粒计数技术。其原理是利用电压驱动待测颗粒穿越人工构建的孔道，监测穿越过程电压脉冲信号，并最终实现颗粒的数量统计。仅通过颗粒与孔道的尺寸匹配进行识别，采用百纳米甚至更大孔的库尔特技术对多数纳米尺寸的生物分子，特别是核酸、蛋白质等缺乏特异性识别能力。近年来，随着纳米加工技术的发展，提取或人工合成具有数纳米或亚纳米尺寸开口的纳米孔道被应用在库尔特技术中。当生物分子与孔道尺寸的高度匹配，通过捕获生物分子穿越孔道时的电压变化，能够特异性识别并实现生物分子的计数。目前，基于库尔特原理，纳米孔已经实现了核酸测序、单分子检测等。然而，在实际应用中，真实样品中的待测物处于复杂环境中。而纳米孔对干扰物极为敏感，干扰物堵塞孔道会产生假信号，并很高几率造成不可逆堵塞，使纳米孔无法继续工作。虽然已公开技术通过纳米孔道修饰探针分子实现特异性识别，但这些技术仍无法实现痕量分子的数量统计。利用百纳米或微米尺度的孔道，基于库尔特技术，建立对待测物质特异性识别的方法，是实现真实样品中生物分子特异性识别和准确数量统计的可行途径之一。目前已公开的技术，可以通过对人工合成微米或百纳米颗粒修饰探针分子，特定捕获待测物，实现特异性检测。然而，微米或百纳米颗粒与捕获待测物，尤其是纳米尺度的蛋白和核酸等，受到修饰条件、识别环境的限制，很难建立颗粒与捕获定量关系，因而无法实现待测物的数量统计。

目前，亟需构建一个基于微米或百纳米孔的检测体系，实现对核酸、蛋白质等待测物的特异性识别，同时建立准确的定量关系，从而实现待测物数量统计。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种准确检测生物分子数量的方法。

本发明的一种检测生物分子数量的方法，通过RCA扩增样品中的生物分子得到DNA纳米球，利用电化学方法对通过具有单一孔道的基层的DNA纳米球产生的电流进行检测，计算得到样品中扩增后的DNA纳米球的数量。

进一步的，所述DNA纳米球的直径大于100nm，所述DNA纳米球的直径不小于所述孔道的直径的1/5。

进一步的，所述孔道的深度小于孔道的直径的40倍。

进一步的，所述基层包括硅的二维膜、氮化硅的二维膜、石墨烯的二维膜或二硫化钼的二维膜，所述孔道为通过聚焦电子、离子束或化学法刻蚀的孔道；

或所述基层包括石英管，所述孔道为石英管拉制的孔道；

或所述基层包括PET薄膜、PC薄膜或PI薄膜，所述孔道为化学刻蚀的核径迹聚合物单孔阵列；

或所述基层为磷脂薄膜，所述孔道为生物体提取或蛋白重结晶的生物蛋白孔道。

进一步的，所述基层和孔道疏水化处理或\和修饰负电荷。基层和孔道修饰排斥待测物吸附不限于疏水化处理，可采用与RCA产物相同电性即负电的聚电解质在孔道表面修饰，通过静电排斥作用，减小滞留和信号丢失的几率。也可以使用Plasma对孔道表面改性，富含带负电羟基实现。也可以将疏水和静电排斥作用相结合，及孔道表面同时疏水化和引入负电荷。