[发明专利]一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用

说明书

本发明提供了一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用，所述引物探针序列分别为目的基因上游引物序列FZD2‑F：SEQ ID No:1 5’‑TTTCTGTCGGGCTGCTACAC‑3’、目的基因下游引物序列FZD2‑R：SEQ ID No:2 5’‑GTAACCGTCCTCGGAGAAGC‑3’、目的基因探针序列FZD2‑P：SEQ ID No:3 5’‑FAM‑GCTCCAGGAGCGCGTGGTGTGCA‑BHQ1‑3’、内参基因上游引物序列EFTUD2‑F：SEQ ID No:4 5’‑CTCAAAGTGCGGGGACTGAT‑3’、内参基因下游引物序列EFTUD2‑R：SEQ ID No:5 5’‑GGCATCAGGGTGACTCCAAA‑3’、内参基因探针序列EFTUD2‑P：SEQ ID No:6 5’‑HEX‑AGCCTGCTTCCTGGGAATGTGCTGCT‑BHQ1‑3’。上述引物探针用于数字PCR试剂盒。本发明试剂盒能快速、特异、灵敏地检测FZD2基因扩增，该试剂盒一步法扩增方法简单、成本低廉，非常适用于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA等各种样本中的基因拷贝数变异情况，适合大范围推广应用。

技术领域

本发明属于肿瘤分子检测技术领域，具体涉及一种检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用。

背景技术

神经母细胞瘤(GBM)已被世界卫生组织指定为IV级癌症，是成人中最常见和致命的CNS肿瘤。目前，针对GBM患者的标准治疗包括最大程度的手术切除，然后同时进行放疗和化疗。Temozolomide(Temodal)是一种DNA烷基化剂，是最常用的化学治疗剂。尽管有这些疗法，大多数患者最终还是复发了。因此，迫切临床需要开发有效的抗GBM治疗剂。

GBM患者的预后普遍较差。GBM肿瘤具有高度异质性。另一方面，GBM似乎也具有细胞层次结构，因此存在一个GBM细胞亚群，该亚群富含肿瘤发生和扩散的能力，这些细胞驱动肿瘤的生长和治疗耐药性。大量研究表明，WNT信号在GBM中被异常激活，并且它通过维持干细胞特性来促进GBM的生长和侵袭。WNT蛋白是一类高度保守的分泌信号分子。自1982年在小鼠乳腺癌模型中发现WNT信号作为致癌基因以来，已有30种WNT信号作为细胞间相互作用，细胞命运决定和迁移的关键调节剂出现。WNT途径成分的突变会导致特定的发育缺陷，而异常的WNT信号传导往往会导致癌症。WNT蛋白与细胞表面上卷曲的(FZD)和低密度脂蛋白受体相关蛋白/α2-巨球蛋白受体(LRP)家族的受体结合。WNT配体分子与受体(FZD2等)结合之后，可激活下游通路，导致转录因子β-Catenin稳定并转入细胞核，最终通过转录调控调节众多靶基因的表达。FZD2是GBM的一个重要靶点，它的扩增可能成为GBM诊断和预后的重要指标。

数字PCR是近十年来兴起的第三代PCR技术，主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，每个反应室或不含待检核酸靶分子，或含有至少一个待检核酸靶分子，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列。经PCR扩增后，分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为”1”，没有荧光信号的微滴判读为”0”，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例给出待检靶分子的拷贝数浓度。数字PCR定量的结果不再依赖于Ct值而直接给出靶序列的起始拷贝数浓度，具有精准、超灵敏度和不易受PCR抑制物影响等优点，能够检测低丰度的肿瘤DNA变异，降低假阴性结果，特别适应于液体活检领域(例如循环肿瘤细胞CTC或循环肿瘤DNA)。因此，开发相关利用数字PCR技术对神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增检测，有利于病程动态跟踪和药物预后监控，大幅度减轻因用药不及时或过度治疗给患者造成的健康损害及对个人、家庭及国家医疗保健体系造成的经济压力和负担，对经济、社会和科技发展有巨大的利益。

发明内容

本发明目的是提供基于数字PCR技术检测神经母细胞瘤复发转移基因FZD2扩增的引物探针及其应用，为实现本发明目的，使用如下的技术方案：