[发明专利]一种转氨酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及一种转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列；其中，所述发生突变的氨基酸序列具有以下至少1个突变位点：第45位、第75位、第108位、第159位、第234位、第272位；且第45位P突变为V或G，第75位L突变为K，第108位G突变为E或D，第159位T突变为Y、H或P，第234位L突变为C，第272位C突变为R或K；所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性。所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示时，该酶突变体的热稳定性较高，且对式(a)所示底物具有较高的催化活性。

技术领域

本发明涉及生物转化领域，具体涉及一种用于催化制备手性胺类化合物的转氨酶突变体及其编码基因。

背景技术

手性胺是手性中心接有官能团“-NH₂”的一类化合物，是一类重要的农药和医药中间体，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物等的合成都是以手性胺作为中间体。然而，传统化学法生产手性胺类化合物的合成路线复杂，成本高，反应条件苛刻，产率及产物的光学纯度不高，同时也易对环境造成严重的污染。

转氨酶(Aminotransferase，EC 2.6.1.X)是一种5-磷酸吡哆醛依赖性酶，它广泛存在于自然界中，并在细胞的氮代谢过程中发挥着重要的氨基转移作用。其能够催化氨基供体(氨基酸或简单的胺)上的氨基转移到前手性的受体酮上，得到手性胺和副产物酮或者α-酮酸。然而，这类转氨酶在工业应用上存在着一些困难，如底物产物抑制作用、底物适用范围较窄等。

针对野生酶转氨酶，目前缺少相关的研究报道，且该酶对式(a)所示类型的底物催化活性低，自身热稳定性也较差。因此，影响以式(b)所示底物为中间体的重要手性医药中间体的生产，造成成本过高、无法规模化生产等问题。

发明内容

基于目前通过化学合成方法制备手性胺类化合物存在的反应步骤多、反应条件苛刻、光学纯度低，以及现有野生型转氨酶存在的催化活性低、热稳定差的问题，本发明针对野生型转氨酶进行基因工程改造，并通过高通量酶活筛选，得到了一种热稳定性好，且对式(a)所示底物催化活性高的转氨酶突变体。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列；其中，所述发生突变的氨基酸序列具有以下至少1个突变位点：第45位、第75位、第108位、第159位、第234位、第272位；且第45位P突变为V或G，第75位L突变为K，第108位G突变为E、D，第159位T突变为Y、H或P，第234位L突变为C，第272位C突变为R或K；所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性。

其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为野生型转氨酶的氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，来源于Aspergillus oryzae(strain ATCC 42149/RIB40)(Yellowkoji mold)。具体地，“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作或有意修饰的。但是，这些基因表达后得到的酶普遍存在对于某些底物的催化活力低，热稳定性较差的缺陷。

作为优选，本发明筛选得到的高活性转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；用于编码该氨基酸序列的转氨酶突变体基因序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的另一方面，提供了一种重组表达载体，其可通过本领域常规方法将含有本发明所述转氨酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种原核表达载体或真核表达载体上构建而成。如pGEX，pMAL，pET系列等原核表达载体以及真核表达载体，更优选地选自pET系列，本发明所使用的载体质粒为pET-24a。