[发明专利]羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记及其区分方法

说明书

本发明涉及一种用于区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述分子标记区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的应用方法包括如下步骤：(1)提取羽衣甘蓝基因组DNA；(2)所述分子标记PCR扩增；(3)限制性内切酶NcoⅠ酶切PCR产物；(4)琼脂糖凝胶电泳检测。本发明建立了一种应用CAPS分子标记在羽衣甘蓝任意发育时期区分表皮蜡质性状的方法，在羽衣甘蓝表皮蜡质鉴定与新品种选育方面具有重要的科学指导意义。

技术领域

本发明属于植物分子领域，具体涉及一种羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记及其区分方法，可用于羽衣甘蓝表皮蜡质性状分子标记辅助选择育种。

背景技术

羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)是十字花科芸薹属二年生观叶花卉。具有色彩鲜艳、形态多样、耐寒性强、观赏期长等优点，是北方早春、晚秋及初冬的重要观赏植物。蜡质是一类亲酯类化合物，附着于植物表面形成疏水层。植物叶片表皮蜡质是抵抗各种生物和非生物胁迫的“物理屏障”。羽衣甘蓝是观叶植物，叶片表皮蜡质含量的多少也影响叶片颜色呈现。

分子标记辅助育种具有快速鉴定目标性状，省时价廉等特点。酶切扩增多态性序列CAPS标记是一种结合PCR扩增与限制性内切酶酶切，检测SNP位点多态性的分子标记技术。CAPS分子标记操作方法简便、价格低廉，主要应用在植物基因分型、分子标记辅助选择育种、品种鉴定等方面。目前尚未见通过分子标记区分羽衣甘蓝蜡质性状的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记及其区分方法，能够在羽衣甘蓝任意发育阶段区分其表皮蜡质性状，加快羽衣甘蓝育种进程。本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

另一方面，本申请还保护一种根据权利要求1所述的分子标记区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)羽衣甘蓝基因组DNA提取：

采用CTAB法，提取待测羽衣甘蓝基因组DNA；

(2)PCR扩增原始序列：

PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸30s秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；

(3)限制性内切酶NcoⅠ酶切PCR产物：

限制性内切酶NcoⅠ识别序列为C^CATGG；

酶切反应体系：PCR产物3μL，NcoⅠ限制性内切酶0.5μL，10×酶切缓冲液2μL，去离子水14.5μL；

酶切反应条件：37℃酶切30分钟；

(4)酶切后PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测：

经凝胶成像仪成像后，当显示出254bp和137bp两条特异性条带时，为表皮蜡质少的羽衣甘蓝；当显示出391bp一条特异性条带时，为表皮蜡质多的羽衣甘蓝。

进一步地，所述方法在羽衣甘蓝发育任意时期均可鉴定羽衣甘蓝蜡质性状。

另一方面，本申请还保护一种用于区分羽衣甘蓝表皮蜡质性状的分子标记的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：