[发明专利]基于陆生环境DNA检测斑翅果蝇的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种适用基于陆生环境DNA定量检测斑翅果蝇虫害的试剂盒产品。试剂盒中包括斑翅果蝇上游引物（BCGY4‑F）、斑翅果蝇下游引物（BCGY4‑R）、Taqman荧光探针和qPCR Mix四种试剂。本试剂盒与其他市售产品，如卡默尔蠕动泵、Millipore聚碳酸酯蚀滤膜、qPCR8连管等的配合使用下，能在与斑翅果蝇混合培养一段时间后的果蔬上定量地检测出斑翅果蝇遗留的DNA量。使用步骤：1.取果蔬，漂洗；2.蚀滤膜过滤漂洗液；3.剪碎滤膜，收集eDNA；4.以eDNA作为模板，进行qPCR反应。此产品既能应用在果园虫害的定性检测上，特异性高、时效性好；又能定量检测出环境中害虫的密度，有利于反映出害虫为害的严重状况、预测下一年虫害的发生。同时，此项产品还有着海关检测外来入侵物种、生态学种群分析方面的潜在价值。

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种基于陆生环境DNA检测斑翅果蝇的试剂盒及其应用。

背景技术

斑翅果蝇（Drosophila suzukii），又称铃木式果蝇，是果蝇科中一种重要的农业害虫。其雌虫的产卵器为坚硬的锯齿状，可将卵直接产于成熟或即将成熟的葡萄、草莓、蓝莓、番茄、樱桃等多种蔬果中，幼虫在果实内取食，同时，在取食点周围迅速开始腐烂，并引发真菌、细菌的二次侵染，加速水果的腐烂。一旦发生虫害，将给果园造成严重的损失。定性检测斑翅果蝇的有无及定量检测斑翅果蝇的密度，将对斑翅果蝇的虫害防治有着重要的指示意义。害虫的定量检测是经过大量实验数据确定斑翅果蝇释放到环境中的DNA量与环境中害虫的密度关系，并进行数据统计，建立相关的函数模型，从而可通过检测环境中残留的害虫DNA量推测出某区域害虫的密度，检测出的害虫密度可以反映出害虫为害的严重状况，以便及时采取措施以减小农作物受虫害所造成的经济损失，也可对下一年虫害的预防提供可参考的依据。

而目前大多数发明都是基于害虫图像识别的自动检测技术，通过采集害虫标本建立物理特征性数据库（音频、图像等）、监控生境获取害虫物理特征，从而对害虫进行分析识别，最终获得害虫的种属和分布信息。如中国专利申请CN201820022929.8：一种害虫检测装置，发明人构建多种物理性传感器，使传感器的输出端与控制器的输入端相接，控制器再与网络通信模块相连，通过各部件的配合，能采集大量经过传感器的害虫的信息。此害虫检测装置可以采集大量现场的图像数据、害虫经过传感器的数量以及害虫检测附近的声音，便于研究人员通过图像数据、害虫经过传感器的数量分析害虫的种类和规模，因而表现出高效、灵敏的特点。但此项装置在害虫检测检疫的准确度方面，由于害虫所处复杂的背景、众多的干扰因素、装置的多重标准以及研究人员判断与分析的误差，使得检测的结果并不十分客观，因此准确度上还有待提高。此类物理检测装置和检测方法存在着相似的优点和不足——即灵敏度高，但特异性差。

近年来，兴起的基于昆虫遗留在环境中的DNA（eDNA）的定量检测技术实现了物种检测中的高特异性和高效性的统一。但由于各类昆虫eDNA的释放量和富集难易程度不一样，目前大多发明应用在水生生境中，例如：

CN201610662966.0中华鲟环境DNA检测PCR扩增引物及其检测方法和应用

CN201920125138.2一种收集海水中环境DNA的装置

CN201510005835.0用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法

CN201510640527.5基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法

等等，都是针对水生生境环境DNA的检测发明;

另有极少数专利与陆生生境的环境DNA相关，如:

CN200710066211.5一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法