[发明专利]一种合成大麻二酚的表达载体、异源表达方法及应用

说明书

本发明公开了一种合成大麻二酚的表达载体、异源表达方法及应用，通过体外从头设计，通过己酰‑CoA合酶、聚酮肽合酶、橄榄酸合酶、异戊烯基转移酶和大麻二酚酸合酶五种酶，构建5个基因表达盒载体，在烟草中瞬时共转化实验表明，通过上述方式可以实现CBD的高产。本发明利用合成生物学技术手段可实现高效生产CBD，其合成产物中不含THC，测定的CBD含量高；此外，烟草作为农业生产的常规经济作物，其种植技术、田间管理和收获叶片的产量等都有优势，可以大大降低种植成本。

技术领域

本发明涉及大麻二酚植物表达技术领域，具体涉及一种合成大麻二酚的表达载体、异源表达方法及应用。

背景技术

大麻二酚(CBD)是工业大麻的主要有效成分。工业大麻又称作汉麻或者火麻，在过去的6000年里，中国一直用汉麻制作一些纺织用品。CBD不同于有精神活性的四氢大麻酚(THC)，它是一种多靶点的药物，有抗炎，镇痛，抗焦虑，抗癌等药理活性，无成瘾性，反而能抵消THC的致幻作用，被称为“反毒品的化合物”。CBD应用广泛，在化妆品中，有修复基底细胞，有抗氧化，抗衰老的功效；做食品添加剂，可以增加食品营养；同时CBD还可以作为癫痫的治疗药物之一。总之，CBD已经渗透到纺织品，药品，化妆品，食品等各个行业。由于CBD产业价值巨大，越来越多的国家和地区开始放开医用大麻合法化，可见，CBD具有巨大的商业价值和广阔的发展前景。

CBD可以通过提取和化学合成来获得。通过化学合成，无论是化学合成或半化学合成的方法，都会受其特殊的化学结构如手性及不对称中心的限制，应用较少。CBD目前主要来源是从工业大麻中直接提取。在CBD的合成路径获得解析后，也有利用微生物异源宿主发酵来生产CBD，这种方法由于高耗氧和耗能，还不能大规模应用。越来越多的天然产物开始利用植物来进行合成，如果利用植物的光合作用来合成，仅以CO₂和水为原料，经光合作用就可以合成各类复杂的天然产物，而无需高耗能、高耗氧的发酵过程。

因此，有必要体外构建合成通路的工程菌，通过侵染植物的方式实现异源表达获得CBD产物，不含THC，并获得高的产量，以推动大规模的应用。

发明内容

鉴于此，本发明目提供一种合成大麻二酚的表达载体、异源表达方法及应用，通过侵染烟草的方式实现异源表达获得产物大麻二酚，并获得高的产量，以推动大规模的应用。

鉴于此，本发明的方案如下：

一种合成大麻二酚的表达载体，包含表达合成大麻二酚所需的酶，所述酶为AAE1、TKS、OAC、CsPT4和CBDAS。

本发明还提出包含如上所述载体的烟草细胞。

本发明还提出如上所述烟草细胞在生产大麻二酚中的应用。

本发明还提出一种构建合成大麻二酚工程菌的方法，采用组合基因表达盒的方式构建编码基因AAE1、TKS、OAC、CsPT4、CBDAS的重组载体，将重组载体转化至农杆菌中即得。

根据本发明的实施例，所述重组载体通过pUC19-TKS分别添加编码目的基因OAC、CsPT4、CBDAS得到中间载体，然后连接pC2300S载体，通过同源重组添加基因AAE1获得。

根据本发明的实施例，在构建所述中间载体时，所述编码基因OAC和CsPT4添加15-20个简并碱基N。

本发明还提出一种通过异源表达生产大麻二酚的方法，将以上所述工程菌侵染烟草叶片，获得表达产物。优选地，通过使用LB培养基培养所述工程菌，重悬后侵染烟草；所述烟草叶片中大麻二酚含量为0.69054mg/mL。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明提供本发明利用植物生物合成CBD，可实现高效生产CBD，烟草作为农业生产的常规经济作物，其种植技术、田间管理和收获叶片的产量等都比工业大麻有优势，可以大大降低种植成本。