[发明专利]一种提高咖啡酸产量的生物制备方法

说明书

本发明公开了一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，涉及生物发酵技术领域。本发明包括构建大肠杆菌基因工程菌、菌体活化、制备种子液、发酵罐培养、诱导表达和生物转化。本发明将SEQ ID NO.1所示的羟化酶基因的核苷酸序列，以pET20b为载体，构建重组质粒pET‑C4H，转入到Escherichia coli Tuner(DE3)中，经过筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌strC4H，诱导表达产生羟化酶，以4‑香豆酸底物，在羟化酶的作用下，4‑香豆酸转化为咖啡酸，提高了咖啡酸的产量，且生物方法制备高效、无污染。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种提高咖啡酸产量的生物制备方法。

背景技术

咖啡酸是是一种有机酸，分子式为C9H8O4，分子量180.15，是从浓水溶液得黄色结晶，从稀水溶液得一水合物。分解点223～225°(在194°软化)。微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。可在化妆品中安全使用，有较广泛的抑菌和抗病毒活性。能吸收紫外线。低浓度即具抑制皮肤型发用染料的助剂，有利于增强色泽的强度。

目前，市场上销售的咖啡酸通常是从植物(单穗升麻根茎和烟草)中提取的，这一分离过程复杂、繁琐，污染环境，而且从植物中获得受限于原材料植物的获得。以酪氨酸为底物采用化学合成，存在大肠杆菌消耗酪氨酸，代谢副产物不好控制，对环境影响较大的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，通过采用生物合成及通过大肠杆菌工程菌产生咖啡酸的方法，解决了现有的咖啡酸生产方法过程复杂、繁琐，污染环境，产量有限的问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，包括以下步骤：

S1:构建大肠杆菌基因工程菌strC4H；(1)以羟化酶基因为模板，加入PCR引物对，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到带有同源臂的基因片段P1；(2)载体pET20b以BamH1/EcoR1为酶切位点，37℃过夜酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到酶切后的线性化载体M1；(3)利用同源重组技术，采用2uL的TAKARA infusion酶将(1)中的基因片段P1和(2)中的线性化载体M1进行连接，其中线性化载体M1和基因片段P1按照摩尔质量比1：2添加，总体系10uL，其余由无菌水补足体系，50℃，30min，得到连接产物M2；(4)将(3)中的连接产物M2转入到DH5A感受态菌株中，涂布含有50μg/mL氨苄霉素的LB平板，挑菌，37℃、220rpm过夜培养后提取质粒，经Bam HI/EcoR1双酶切验证筛选出正确的重组质粒，标记为pET-C4H；(5)将(4)中的重组质粒pET-C4H转入Escherichia coli Tuner(DE3)感受态菌株中，加入50μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄，筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌，标记为strC4H；

S2：菌体活化；取S1中的大肠杆菌基因工程菌strC4H，二次摇瓶活化后，接种于平板培养基中，4℃保存；

S3：制备种子液；取S2中的平板培养基，挑取单菌落，摇瓶活化，置于50ml的种子培养基中培养12小时，获得种子液；所述种子培养基的配方为：每1000ml培养基，加入酵母粉5g，胰蛋白胨10g和氯化钠10g,余量为水，PH7.0；