[发明专利]一种提高咖啡酸产量的生物制备方法

权利要求书

1.一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：构建大肠杆菌基因工程菌strC4H；

(1)以羟化酶基因为模板，加入PCR引物对，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到带有同源臂的基因片段P1；

(2)载体pET20b以BamH1/EcoR1为酶切位点，37℃过夜酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到酶切后的线性化载体M1；

(3)利用同源重组技术，采用2uL的TAKARA infusion酶将(1)中的基因片段P1和(2)中的线性化载体M1进行连接，其中线性化载体M1和基因片段P1按照摩尔质量比1：2添加，总体系10uL，其余由无菌水补足体系，50℃，30min，得到连接产物M2；

(4)将(3)中的连接产物M2转入到DH5A感受态菌株中，涂布含有50μg/mL氨苄霉素的LB平板，挑菌，37℃、220rpm过夜培养后提取质粒，经Bam HI/EcoR1双酶切验证筛选出正确的重组质粒，标记为pET-C4H；

(5)将(4)中的重组质粒pET-C4H转入Escherichia coli Tuner(DE3)感受态菌株中，加入50μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄，筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌，标记为strC4H；

S2：菌体活化；

取S1中的大肠杆菌基因工程菌strC4H，二次摇瓶活化后，接种于平板培养基中，4℃保存；

S3：制备种子液；

取S2中的平板培养基，挑取单菌落，摇瓶活化，置于50ml的种子培养基中培养12小时，获得种子液；所述种子培养基的配方为：每1000ml培养基，加入酵母粉5g，胰蛋白胨10g和氯化钠10g,余量为水，PH7.0；

S4：发酵罐培养；

将S3中的种子液按照3％-5％的接种量接种于发酵罐内的发酵培养基中，边通气边搅拌，温度控制37℃，搅拌速度500rpm-800rpm，通气量(5V/V.min)，添加5％氢氧化钠控制pH至7.0；采用恒pH流加方法向发酵罐内添加补料培养基进行补料，以促进大肠杆菌基因工程菌strC4H的持续生长；

所述发酵培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油5g，酵母提取物7.5g，蛋白胨30g，氯化钠0.5g，柠檬酸2g，磷酸氢二钾14g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁1.2g和微量元素，余量为水，PH7.0；其中微量元素包括七水硫酸亚铁2g、二水氯化钙13.5g、五水硫酸镁0.75g、六水氯化钴0.13g、七水硫酸锌0.75g、二水氯化铜0.16g和二水钼酸钠0.13g；

所述补料培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油250g、酵母粉60g和蛋白胨60g，余量为水；

S5：诱导表达；

在菌株发酵至比生长速率为0.1时，加入诱导剂，温度控制30℃，进行诱导表达产生羟化酶；

S6：生物转化；

取1L发酵液，分批加入中底物4-香豆酸，反应10小时后，采用高效液相色谱法对发酵液中咖啡酸的含量进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S1中的羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述S5中的羟化酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S1中的载体pET20b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S4中的诱导剂为20g/L乳糖。

5.根据权利要求4所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S1中的PCR引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述PCR引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S4中种子液的接种量为4％。