[发明专利]一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法及应用

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法，通过样本DNA提取，ARMS‑qPCR法扩增样本DNA，通过设置A、B两组扩增组在同一台仪器上同时进行扩增检测。本发明中通过设置两组扩增组在同一台仪器上同时扩增检测，能够快速准确的鉴别风险人群，大大提高了检测基因的特异性，低污染，检测时间短。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法及应用。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是眼科常见的神经退行性疾病,也是欧美等发达国家老年人群致盲的主要原因。据统计,发达国家AMD发病人数将达300万,50岁以上人群眼病患病率中,AMD占3.5％。当前,AMD已成为世界公共卫生组织重点关注的疾病。AMD发病过程主要是光感受器、视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelial,RPE)细胞及血液供应改变,造成视神经退行性萎缩,病情进展至末期形成中心视力不可逆性丧失。AMD发病机制尚未明确,年龄、饮食、环境、遗传以及种族等因素与发病过程密切相关。目前老年性黄斑病变的常规检测手段只能在黄斑病变有明显症状后作出诊断，可能会延误最佳治疗时机。

基因多态性检测是指以含有遗传信息的物质(如血液)为起始材料，通过核酸提取、扩增和对扩增产物进行表征等过程检测基因序列的差异，目前报道的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法主要有：直接测序法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、PCR-RFLP法、Taqman探针法、突变扩增系统(amplification refractorymutation system,ARMS)PCR法等。直接测序法虽是SNP分析的金标准，可发现已知和未知的SNP位点，但每个位点均需经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期长、不适合大样本做疾病关联分析，且易发生交叉污染。Taqman探针法适合少量位点大量样本的分型项目，但其探针合成价格昂贵，不适合少量样本多位点分型，特别是频率偏低的位点。PCR-RFLP法优点是分型技术简单，结果判定容易，避免测量误差，结果稳；其缺点是序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列，遗传标记系统的个人识别能力有限，限制酶消化条件较高。HRM法可高通量检测基因的突变情况，但其所需检测仪器比普通的荧光PCR仪更为精密，对温度敏感性要求高，受仪器影响大很难普及。ARMS-PCR法，又称等位基因特异性扩增法，其基本原理是因为Taq DNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。ARMS-PCR可检测DNA分子上任何点突变和小的缺失，其方法可靠、不依赖于任何特殊标记，但往往反应结束后还需进行凝胶电泳，增加了PCR污染的机会，且耗时费力。因此，迫切需要开发一直高灵敏度，经济实惠、快速且结果判读准确可靠的检测方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法，能够快速准确的鉴别风险人群，大大提高了检测基因的特异性，低污染，检测时间短。

本发明提供了一种快速鉴别老年黄斑病变风险的方法，具体包括如下步骤：

S1，样本DNA提取；

S2，ARMS-qPCR法扩增样本DNA：

以S1中提取的样本DNA为模板，设置野生型引物扩增组，记为A组，设置突变型引物扩增组，记为B组，A组和B组的正向引物均为CFH-F，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示；

A组反向引物记为CFH-R(T)，其序列如SEQ ID NO.2所示；

B组的反向引物记为CFH-R(C)，其序列如SEQ ID NO.3所示；