[发明专利]针对C型逆转录病毒的数字PCR检测用引物及检测方法

说明书

本申请属于病毒检测技术领域，具体涉及一种针对C型逆转录病毒（C‑type retrovirus）的数字PCR（dPCR）检测技术专利申请事宜。针对C型逆转录病毒设计引物组，适用于数字PCR检测应用。现有技术中，针对CHO细胞中C型逆转录病毒检测时，QPCR技术是最为常用技术。但鉴于QPCR检测结果准确性问题，为了进一步提高检测的准确度，结合新兴的绝对定量的数字PCR技术，本申请中，发明人通过对特异性引物序列筛选和反应体系优化，明显提高了C型逆转录病毒检测的准确性，提高了以CHO细胞为宿主表达系统的质控标准，同时也为其他病毒检测、细胞基因治疗技术的应用提供了良好的借鉴和参考。

技术领域

本申请属于病毒检测技术领域，具体涉及一种针对C型逆转录病毒（C-typeretrovirus）的数字PCR（dPCR）检测技术专利申请事宜。

背景技术

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种药用重组蛋白和疫苗生产中的常用细胞，其具有如下优良特点：(1)适用于悬浮培养，可以满足大规模工业生产重组蛋白的要求；(2)产生的抗体分子在结构、功能方面和天然抗体分子较接近；(3)所含人类病毒极少；(4)外源基因可以在CHO细胞中稳定地整合；(5)CHO细胞是成纤维细胞，几乎不分泌内源性蛋白，因此对目标重组抗体的分离纯化工作十分有利。

尽管CHO细胞中没有人类病毒，并且应用较为广泛。但已有研究也已证实，CHO 细胞可以表达内源性逆转录病样颗粒，在细胞上清中通常可以检测到 10^3~10⁹ /ml的逆转录病毒样颗粒，尤其是通过电子显微镜可以清楚观察到CHO细胞中含有C型逆转录病毒颗粒。也因此，为了保证在CHO细胞中表达生产的抗体药和疫苗等重组蛋白药物的安全性，需要在生产环节和纯化后对相关病毒颗粒量进行准确检测和定量，尤其是CHO细胞系中C型逆转录病毒的定量检测。

现有技术中，最常用的分子检测方法是荧光定量PCR（QPCR）法，其可以通过利用Taqman探针法特异性检测C型逆转录病毒颗粒的含量。由于每个逆转录病毒颗粒包含两个病毒基因组RNA分子，因此，通过检测病毒基因组RNA拷贝数，便可以推算出每制剂的病毒含量。但由于荧光定量PCR属于相对定量，因此，在具体绝对定量病毒拷贝数时需要先用标准品绘制标准曲线，由此导致病毒拷贝数检测结果主要取决于标准品（标准曲线）的准确性。但实际检测定量中，影响定量PCR检测结果的准确性因素还有：扩增效率、PCR干扰因素、标准品的准确性等诸多因素。此外，C型逆转录病毒的定量检测时，一般是取CHO细胞培养上清来纯化病毒核酸，而上清中大量的细胞碎片、蛋白、杂质核酸等杂物，也会干扰PCR扩增，进而导致检测结果不准确。正是基于这些问题，急需一种较好的、较为简便的病毒拷贝数准确定量方法，从而为相关病毒含量的准确确定奠定基础。

数字PCR技术作为第三代PCR技术，是一种单分子扩增技术，是一种不依赖标准品的绝对定量技术。与传统的荧光定量相比，可实现单分子检测，具有检测准确性高、灵敏性高和抗PCR扩增抑制能力的优点。与QPCR相同，数字PCR技术可以利用TaqMan探针或SYBRGreen染料进行荧光信号检测，最后利用终点信号检测法和泊松分布统计计算，实现样品的绝对定量。

鉴于QPCR在CHO细胞的C型逆转录病毒检测中仍然存在明显改进空间，因此，如何利用数字PCR技术来实现和改进CHO细胞中C型逆转录病毒检测工作，对于确保相关产品质量的稳定性具有十分重要的技术意义。

发明内容

针对现有CHO细胞中的C型逆转录病毒，本申请目的提供一组针对C型逆转录病毒的数字PCR检测用引物，从而为相关病毒颗粒的准确检测和定量奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

针对C型逆转录病毒的数字PCR检测用引物组，该引物组针对C型逆转录病毒（C-type retrovirus，GenBank accession number：U09104）设计，适用于数字PCR（dPCR）检测应用，具体引物设计为：