[发明专利]一种微微型蓝细菌的检测引物及检测方法

说明书

本发明公开了一种微微型蓝细菌的检测引物及检测方法。本发明针对海洋微微型蓝细菌“Syn/Pro”类群的16S‑23S rRNA ITS序列而设计的特异性引物，命名为Picocya‑Ala‑F/Picocya‑boxA‑R，本发明的引物可以覆盖海洋中丰度高、分布广泛的蓝细菌类群，适合海洋环境不同介质(海水、表层沉积物、柱状沉积物等)中微微型蓝细菌的快速准确定量。本发明系首次利用分子生物学方法(qPCR)进行海洋微微型蓝细菌各类群总丰度的定量，因此其应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种微微型蓝细菌的检测引物及检测方法。

背景技术

海洋微微型蓝细菌，主要包括原绿球藻属(Prochlorococcus)和聚球藻属(Synechococcus)，是海洋中主要的初级生产者，在寡营养海域其对初级生产力的贡献可达50％。目前，微微型蓝细菌的定量方法主要包括三种，即显微计数法、流式细胞计数法及分子生物学计数法。其中，显微计数法针对的是所有蓝细菌类群，难以区分不同类群并且观察费时、结果误差较大；流式细胞计数法快速、准确，但同样具有自身的缺陷。首先，对于微微型蓝细菌丰度较低的样本，流式细胞计数法比较困难且误差较大，尤其是海洋真光层底部样本；其次，流式细胞计数法无法应用于不同粒径条件(如0.2-3μm、＞3μm)的海水及沉积物环境条件中，并且只能针对原绿球藻、聚球藻等大类群，而无法区分更细致的蓝细菌类群。显微计数法可以对沉积物及不同粒径条件海水的蓝细菌进行定量，但其通量比较低、费时且样品前处理比较复杂。

分子生物学计数法(如real time polymerase chain reaction，qPCR)可以很好地克服上述两种方法的缺陷。应用此方法，海洋中不同蓝细菌(原绿球藻、聚球藻)生态型的分布模式已被详细地阐述。同时，也有一些特定引物(CYAN108F-CYAN377R、CYA359F-CYA781R等)被设计用以定量淡水中蓝细菌的丰度。但是，目前为止鲜有一对特异性引物被用来定量海洋微微型蓝细菌各种类群的总丰度。海洋微微型蓝细菌的类群多样且有的种类丰度较低，因此覆盖面广、特异性强是蓝细菌引物设计的重要考量因素，对于我们准确定量蓝细菌的丰度具有特别重要的意义。

发明内容

为了解决上述蓝细菌引物的设计问题，更好地解决蓝细菌准确定量的问题，本发明提供了一种微微型蓝细菌的检测引物。本发明中的检测引物所覆盖的海洋微微型蓝细菌的多样性较高，通过该引物应用于实时荧光定量PCR检测，旨在促进分子生物学在海洋蓝细菌检测中的应用，解决蓝细菌丰度的准确定量问题。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明发现一对能够特异性扩增海洋微微型蓝细菌16S-23S核糖体RNA转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)的检测引物Picocya-Ala-F和Picocya-boxA-R，可以用于海洋环境中微微型蓝细菌各种类群总丰度的定量。本发明中的检测引物是针对海洋微微型蓝细菌“Syn/Pro”分支的16S-23S rRNA ITS序列而设计的特异性引物，命名为Picocya-Ala-F/Picocya-boxA-R，其中Picocya-Ala-F(正向引物序列)为5’-GCTTTGCAAGCAGGATGTCAG-3’(如SEQ ID NO.1所示)，Picocya-boxA-R(反向引物序列)为5’-CTATGCAGTTGTCAAGGTTC-3’(如SEQ ID NO.2所示)。

本发明的第二个目的是提供一种微微型蓝细菌的检测试剂盒，包括上述的检测引物Picocya-Ala-F/Picocya-boxA-R。

本发明的第三个目的是提供一种微微型蓝细菌的检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用上述的检测引物Picocya-Ala-F/Picocya-boxA-R进行qPCR，反应结束后，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有微微型蓝细菌。