[发明专利]一种微微型蓝细菌的检测引物及检测方法

权利要求书

1.一种微微型蓝细菌的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

Picocya-Ala-F：5’-GCTTTGCAAGCAGGATGTCAG-3’；

Picocya-boxA-R：5’-CTATGCAGTTGTCAAGGTTC-3’。

2.一种微微型蓝细菌的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物。

3.一种微微型蓝细菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的检测引物Picocya-Ala-F/Picocya-boxA-R进行qPCR，反应结束后，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有微微型蓝细菌。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的根据扩增曲线判断待测样品中是否含有微微型蓝细菌的标准为：如果扩增曲线有典型扩增曲线，则说明待测样品中含有微微型蓝细菌，如果扩增曲线无典型扩增曲线，则说明待测样品中不含有微微型蓝细菌。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的qPCR，其qPCR体系为：每25μL包括以下组分：10μmol/L的权利要求1所述的检测引物Picocya-Ala-F和Picocya-boxA-R各1.0μL、2×Green Pro Taq HS Premix 12.5μL、DNA模板1.0μL、无菌水9.5μL；qPCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，61.3℃退火30s，72℃延伸45s，收集荧光信号，重复45个循环。

6.一种微微型蓝细菌丰度的定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将以若干不同种蓝细菌的基因组DNA为模板，权利要求1所述的检测引物Picocya-Ala-F/Picocya-boxA-R为扩增引物得到的PCR扩增产物分别连接到质粒上，构建得到若干重组质粒，将重组质粒等量混合后得到混合重组质粒，然后将混合重组质粒梯度稀释以用作不同起始混合标准子浓度的模板，利用权利要求1所述的检测引物Picocya-Ala-F/Picocya-boxA-R建立qPCR体系进行qPCR；

(2)反应结束后得到各起始混合重组质粒浓度模板对应的循环数Ct，以混合重组质粒浓度的对数值为横坐标，循环数Ct为纵坐标，建立标准曲线；

(3)提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的检测引物Picocya-Ala-F/Picocya-boxA-R建立与步骤(1)相同的qPCR体系进行qPCR，反应结束后得到循环数Ct，将其代入标准曲线，计算得到待测样品中微微型蓝细菌的丰度。

7.根据权利要求6所述的定量方法，其特征在于，步骤(1)所述的qPCR体系为：每25μL包括以下组分：10μmol/L的权利要求1所述的检测引物Picocya-Ala-F和Picocya-boxA-R各1.0μL、2×Green Pro Taq HS Premix 12.5μL、DNA模板1.0μL、无菌水9.5μL。

8.根据权利要求6或7所述的定量方法，其特征在于，步骤(1)和(3)所述的qPCR，其qPCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，61.3℃退火30s，72℃延伸45s，收集荧光信号，重复45个循环。

9.权利要求1所述的检测引物在检测微微型蓝细菌丰度中的应用。

10.权利要求1所述的检测引物在检测微微型蓝细菌多样性中的应用。