[发明专利]一种黄曲霉毒素M1的检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种黄曲霉毒素M1的检测方法及其应用，包括(1)制备纳米颗粒探针；(2)将检测样品与适配体混合，加入t‑DNA进行扩增，得到扩增产物；(3)将步骤(1)得到的纳米颗粒探针与步骤(2)得到的扩增产物混合，检测混合前后的纳米颗粒探针粒径变化情况。本发明中的N‑SDA和DLS检测方法操作简单、灵敏度高，检出限为1.3pmol/L，对AFM1检测具有特异性响应，不受其他毒素的干扰，在乳制品中也具有良好的适用性，为AFM1的分析检测提供了新的途径。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素M1的检测方法及其应用。

背景技术

真菌毒素是真菌产生的一类有毒的次级代谢产物，它们会对各种食物和动物饲料造成污染。由于其毒性和致癌特性，真菌毒素对人体已构成了严重的健康威胁。

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉产生的主要毒素之一，在黄曲霉毒素类中，黄曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最强、影响最大的。当动物摄入受AFB1污染的饲料后，AFB1会在动物体内发生羟基化，从而代谢产生黄曲霉毒素M1(AFM1)。因此，AFM1主要存在于体内环境中，如动物的乳汁和血液中，由于基于这些动物来源的材料其在食品加工过程中具有很高的稳定性，因此可以存在各种乳制品或血液制品中。尽管AFM1的毒性低于AFB1，但它对肝脏具有毒害性并且具有致癌作用，因此也具有人体健康威胁性。

相关技术中，针对于AFM1或其他真菌毒素的分析检测主要包括比色法、荧光分析法和电化学方法，但这些方法都在一定程度上无法达到高灵敏度的技术要求，检出限也不能满足痕量检测的需求。DNA扩增技术是一种具有相对高灵敏度的检测技术，但其在AFM1或其他真菌毒素的分析领域中相对应用较少。

动态光散射是一种用于测量颗粒水动力直径的光学技术，多用于大分子的性能检测，如检测DNA、蛋白质等，但对于小分子化合物的检测应用较少。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种黄曲霉毒素M1的检测方法，该方法主要利用的是设计得到的DNA-AuNP探针。在样品中存在AFM1时，通过AFM1与适配体结合从而释放出与适配体杂交的互补链，该互补链与之后加入的模板DNA杂交，在聚合酶和dNTPs存在的情况下进行延伸，之后在DNA切割酶存在的情况下循环得到大量的单链DNA产物，该产物可与设计得到的DNA-AuNP探针杂交，从而导致金纳米颗粒发生聚集，最后通过测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对AFM1的高灵敏定量分析。

本发明的第一个方面，提供一种纳米颗粒探针，该纳米颗粒探针包括：

金属纳米颗粒；和

DNA片段，所述DNA片段通过巯基自组装在所述金属纳米颗粒表面；

其中，所述DNA片段的5’端或3’端连接有巯基。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述金属纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒。

当然，可以根据实际使用需求，合理替换为其他金属纳米颗粒。

在本发明的一些优选实施方式中，所述金属纳米颗粒包括金纳米颗粒。

本发明中的金纳米颗粒的制备是根据经典的柠檬酸钠还原法，并做了适当的调整。将2mL新鲜配制的38.8mM柠檬酸钠溶液迅速加到20mL煮沸的1mM氯金酸HAuCl₄溶液中，反应液由淡黄色变为黑色，再变成紫色，最后变为酒红色，继续加热回流并搅拌10分钟。最后，让反应液冷却至室温并保持搅拌，然后用0.45微米的尼龙滤膜过滤，保存在4度冰箱中备用。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述DNA片段的核苷酸序列为：

5’-CCTTCTCTTT-3’(SEQ ID NO.4)；和/或