[发明专利]外泌体中核酸分子的检测方法在审
| 申请号： | 202110496477.3 | 申请日： | 2021-05-07 |
| 公开（公告）号： | CN113151398A | 公开（公告）日： | 2021-07-23 |
| 发明（设计）人： | 徐学明;冯韵;田金金;冯菲菲 | 申请（专利权）人： | 广州复能基因有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806 |
| 代理公司： | 中科专利商标代理有限责任公司 11021 | 代理人： | 高丽娜 |
| 地址： | 510663 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 外泌体中 核酸 分子 检测 方法 | ||
1.外泌体中核酸分子的检测方法，其包括以下步骤：
裂解样品中的外泌体，用于释放外泌体核酸分子；优选地，所述样品为细胞培养液、血浆、尿液或其它体液样品；
逆转录反应，其中所述外泌体裂解后不经过提取核酸分子或经过提取核酸分子后进行所有RNA的逆转录反应，即RT-For-All，使外泌体中所有RNA在同一反应中同时进行逆转录；
其中在所述逆转录反应中使用包含通用接头(例如，miRNA Adapter)和随机引物的逆转录缓冲液；
优选地，在逆转录反应之后进行定量PCR或测序检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述核酸分子包括RNA(例如mRNA、miRNA、lncRNA、cirRNA)和DNA。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，在所述外泌体的裂解步骤中使用外泌体裂解缓冲液进行裂解，其中，所述裂解缓冲液包括pH缓冲盐(优选Tris-Cl)、BSA、RNase抑制剂和非离子去垢剂；
优选地，所述非离子去垢剂为TritonX-100、Tween20、NP-40、Igepal的任意一种或多种的组合。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述裂解缓冲液还包括蛋白酶K，用于抑制核酸酶活性并保护核酸不被降解；优选地，所述裂解缓冲液还包括DTT。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其中在所述逆转录反应步骤中使用逆转录反应体系，其包括逆转录缓冲液、逆转录酶和PolyA聚合酶，优选还包括dNTP和ATP。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述逆转录反应的条件包括37℃-42℃，5-30min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其中RT-For-All逆转录反应的产物可直接用作多种检测的底物，例如用于定量PCR(qPCR)进行核酸检测；也可用作文库构建用于核酸NGS。
8.用于检测外泌体中核酸分子的试剂盒，其包括逆转录反应体系；其中，所述逆转录反应体系包括逆转录缓冲液、逆转录酶和PolyA聚合酶，优选还包括dNTP和ATP；
其中所述逆转录缓冲液包括用于逆转录小分子RNA的通用接头(例如，miRNA Adapter)和用于逆转录大分子RNA的随机引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其还包括裂解缓冲液，其中所述裂解缓冲液包括pH缓冲盐(优选Tris-Cl)、BSA、RNase抑制剂和非离子去垢剂；
优选地，所述非离子去垢剂为TritonX-100、Tween20、NP-40、Igepal的任意一种或多种的组合。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述裂解缓冲液还包括蛋白酶K，用于抑制核酸酶活性并保护核酸不被降解；优选地，所述裂解缓冲液还包括DTT。
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