[发明专利]一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于背景信号抑制探针的8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用。本发明利用Lambda核酸外切酶对底物结构的选择性以及8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶对8‑氧代鸟嘌呤的识别切割作用，结合背景信号抑制探针对λexo副活性的抑制作用，构建了一种新的8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶荧光测定方法。具体包括：将λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的报告探针序列、含有8‑氧代鸟嘌呤的背景信号抑制探针序列混合；将混合液加热至85℃，然后逐渐冷却至37℃，加入待测样品；在37℃下孵育；孵育结束后加入λexo，进行酶切反应，之后进行荧光检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用。

背景技术

8-氧代鸟嘌呤是一种常见的由于活性氧引起的DNA氧化损伤，该损伤易引起基因突变，可使生命体的健康受到严重影响。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoguanine DNAglycosylase,OGG)是DNA修复过程中的关键酶。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶既有N-端糖基化酶活性，也有AP(apurinic/apyrimidinic)-裂解酶活性。N-端糖基化酶活性可以切下双链DNA上受损的嘌呤碱基，产生一个AP位点。AP-裂解酶活性可以切割AP位点的3′或5′端，产生一个具有3′和5′磷酸的碱基缺口。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶可识别并切除8-氧代鸟嘌呤，对机体DNA氧化损伤的修复有着重大的意义。近期研究还表明，8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶是多种疾病的重要生物标志物，如膀胱癌、胆囊癌、肺癌等。因此，快速准确地分析8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性具有重要意义。

传统的DNA糖基化酶检测方法有酶联免疫吸附法、凝胶电泳、放射性标记和色谱法等。这些方法由于具有放射性危害、复杂耗时等固有缺陷，难以满足目前的分析需求。而荧光法由于具有简单、安全、灵敏度高等独特优势，目前已广泛应用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性分析。然而，现有的荧光方法有一个难题，即方法的灵敏度总是与检测体系的复杂性成正比。具有高灵敏度的荧光检测方法往往需要使用到多种昂贵材料，导致检测成本高昂，操作流程复杂。如使用量子点的应用可使检测限(limit of detection,LOD)低至1.8×10^-3U/mL，但量子点的制备过程复杂，不易实际应用；而简单检测体系的灵敏度则往往难以满足检测需求。现有的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶荧光检测方法无法兼顾低成本与高灵敏度。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法、试剂盒及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明提供的该方法利用Lambda核酸外切酶(λexo)对底物结构的选择性以及8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶对8-氧代鸟嘌呤的识别切割作用，结合背景信号抑制探针对λexo副活性的抑制作用，构建了一种新的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶荧光测定方法来高灵敏度、简单、快速、低成本地检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的活性。

本发明是这样实现的，一种基于背景信号抑制探针的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶测定方法，其特征在于，包括：

将λexo缓冲液、含有荧光基团及猝灭基团的报告探针序列、含有8-氧代鸟嘌呤的背景信号抑制探针序列混合；背景信号抑制探针在8-氧代鸟嘌呤位点处被切割后，与报告探针在5’-荧光基团末端形成2-nt突出结构；

将混合液加热后逐渐冷却，之后，加入待测样品孵育；

孵育结束后加入λexo，进行酶切反应，之后进行荧光检测。在进行未知样品检测前，先利用已知浓度样品的荧光变化率建立标准曲线。

进一步地，所述含有荧光基团及猝灭基团的报告探针序列为：荧光基团-CCTCCACAGACACATAC-猝灭基团。