[发明专利]一种聚合物微球及其制备与应用

说明书

本发明公开了一种聚合物微球及其制备与在制备抗体纯化填料中的应用，所述聚合物微球是以聚乙烯醇和海藻酸钠为原料，加入水在80‑100℃溶解后，降温至40℃后加入含ZZ融合蛋白的重组大肠杆菌菌液制成水相；再将液体石蜡和表面活性剂混合为油相，水相缓慢滴加到油相中，30‑70℃搅拌形成乳液后，再加入饱和硼酸氯化钙水溶液，制备得到所述的聚合物微球；所述ZZ融合蛋白是将ZZ蛋白通过连接肽与锚定蛋白(LppOmpA)融合而成；本发明方法制备的聚合物微球的直径为50‑250nm，超大孔径为1μm至2μm，原料廉价，成本低，操作简单，省略了常规配基的表达、纯化、接枝等制备过程，解决了配基昂贵等问题。

(一)技术领域

本发明涉及一种聚合物微球及其制备与应用。

(二)背景技术

抗体类药物因其具有靶向性强、特异性高和毒副作用小等特点，在临床被广泛应用于疾病的诊断、治疗及免疫等方面，应用前景广阔。然而，抗体药物生产技术门槛较高，涉及到抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建、大规模悬浮培养及下游纯化等核心技术，随着分子生物学技术的飞速发展，在抗体筛选、重组、人源化等上游技术方面已没有太多障碍，目前的困难主要集中在中游的大规模生产及下游纯化等方面。当前，约80％的下游工艺采用Protein A亲和层析进行快速捕获，由于Protein A对抗体具有良好的特异结合能力，而且操作简单，因此被广泛的利用。然而，Protein A因分子量较大，表达困难，而且表达后的Protein A还需要一系列的分离纯化，接枝修饰等过程，造成Protein A亲和填料的市场化价格比较昂贵，目前国内成规模生产Protein A亲和填料的公司很少，加之国内抗体培养表达的规模较小，色谱操作处理能力受限，因此生产成本居高不下，缺少市场竞争力。

因此，研究可替代载体及纯化技术具有重要的现实意义，近年来研究替代蛋白A的小分子功能基逐渐增多，其中最典型的疏水电荷诱导层析，利用疏水作用吸附抗体；调节pH值，使杂环带电实现洗脱，成为比较有潜力的替代蛋白A的纯化抗体模式。另外，Protein A亲和介质其配基主要来源于金黄色葡萄球菌蛋白A(StaphyIococcal Protein A，SPA)，其作为一种“广泛二抗”，能与抗体分子的Fc片段具有良好的亲和特性，被广泛的应用于抗体纯化领域。SPA是位于革兰氏阳性金黄色葡萄球菌表面的细胞壁相关蛋白结构域，蛋白分子量为42kDa，由16种氨基酸(不含半胱氨酸及胱氨酸)组成，无二硫键及复杂的三级结构，因此天然结构十分稳定。由于SPA蛋白较大，表达过程中可能需要面临蛋白质二级结构发生折叠变形等问题。因此人们通过对SPA蛋白的基因结构进行分析，认为其与IgG结合区主要由E、D、A、B和C五个高度同源的IgG结合结构域组成，都能与IgG1，IgG2和IgG4的Fc段独立结合，且都显示具有较强的免疫球蛋白亲和活性，其中B结合结构域的结合力最强，同时为了提高B结构域对羟基胺介导的融合蛋白位点特异性化学裂解的耐受性，对B结构域进行基因改造(一个氨基酸残基发生突变)成Z结构域，可应用于固定化亲和配体捕捉IgG中，同时可通过对Z结构域首尾串联聚合，使其具有更强的捕捉抗体的能力，同时可将其作为一种可自我再生的固定化蛋白基质用于抗体纯化亲和色谱载体的大批量制备。

本发明利用DNA重组技术将抗体结合域ZZ蛋白通过具有展示大分子蛋白潜能的Lpp-OmpA展示系统展示在大肠杆菌表面，不经过解析、纯化，通过多孔载体包埋重组大肠杆菌简单培养，快速获得大量廉价的抗体亲和色谱填料并用于抗体纯化，对部分解决现有填料制备工艺复杂，成本高昂的局限性，降低生产成本具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种用于IgG纯化的聚合物微球及其制备方法与应用，以聚乙烯醇和海藻酸钠为原料，加入重组大肠杆菌后与饱和硼酸氯化钙溶液进行交联得到的微球，通过重组大肠杆菌的简单培养就可以快速获得大量价廉的抗体亲和色谱填料，作为色谱介质应用于抗体分离纯化中，操作简化，价格低廉。

本发明采用的技术方案是：