[发明专利]枇杷炭疽病菌巢式PCR特异性引物及其检测方法和应用在审
| 申请号： | 202110442148.0 | 申请日： | 2021-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN113025744A | 公开（公告）日： | 2021-06-25 |
| 发明（设计）人： | 吴頔;袁婷;梁国鲁;郭启高;张红楠 | 申请（专利权）人： | 西南大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6848;C12Q1/04;C12N15/11 |
| 代理公司： | 重庆智慧之源知识产权代理事务所(普通合伙) 50234 | 代理人： | 高彬 |
| 地址： | 400715*** | 国省代码： | 重庆;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 枇杷 炭疽 病菌 pcr 特异性 引物 及其 检测 方法 应用 | ||
1.一种枇杷炭疽菌巢式PCR特异性引物，其特征在于：所述枇杷炭疽菌为枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)或枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)；
所述枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS区内侧特异性引物的上游引物Cg1F:5’-GAAGGAAGGGTCTCCGCGAC-3’；
所述枇杷胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的ITS区内侧特异性引物的下游引物Cg1R:5’-TCCTAGTGCGAGACGTAA-3’；
所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS区内侧特异性引物的上游引物Ca1F:5’-ACCCTTTGTGACATACCTAACC-3’；
所述枇杷尖孢炭疽菌(C.acutatum)的ITS区内侧特异性引物的下游引物Ca1R:5’-GAGCCGAGTTCAACCTGTAA-3’。
2.如权利要求1所述枇杷炭疽菌巢式PCR特异性引物，其特征在于：巢式PCR的检测过程中，所述枇杷炭疽菌的ITS区外侧通用引物的上游引物：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；所述枇杷炭疽菌的ITS区外侧通用引物的下游引物：ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
3.一种枇杷炭疽菌巢式PCR高效检测方法，其特征在于：先提取待测样品基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述通用引物作为第一轮反应引物进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR反应产物作为第二轮PCR扩增的模板，权利要求1所述特异性引物对Cg1F/R或Ca1F/R作为第二轮PCR扩增引物进行第二轮PCR扩增，最后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过目标片段判定供试样品是否携带胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：第一轮PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：第二轮PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：若利用引物对Cg1F/R扩增出一条392bp的特异性条带，则确定所测样本为胶孢炭疽菌或被胶孢炭疽菌侵染的枇杷组织；若利用引物对Ca1F/R扩增出一条490bp的特异性条带，则确定所测样本为尖孢炭疽菌或被尖孢炭疽菌侵染的枇杷组织。
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