[发明专利]一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明首先在大肠杆菌EcN(Escherichia coli Nissle 1917)中筛选异源表达UDP‑N‑乙酰葡萄糖胺和UDP‑葡萄糖醛酸途径基因glmS、glmM和glmU以及galU和ugd，通过途径基因组合，过表达EcN来源肝素前体合酶基因，摇瓶水平达到1.29g/L，发酵罐优化肝素前体产量达到15g/L。

技术领域

本发明涉及一种产肝素前体的重组大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

肝素前体(Heparosan)是一种酸性天然产物多糖，是肝素和乙酰肝素的生物合成的前体多糖。肝素前体的骨架是由D-葡萄糖醛酸(GLCA)和N-乙酰-α-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)通过α-1,4和β-1,4糖苷键交替连接而成的重复双糖单元组成线性多糖。肝素前体在大肠杆菌K5和多杀性巴氏杆菌等细菌中被生物合成为多糖胶囊。在真核生物中，肝素前体是肝素和硫酸乙酰肝素生物合成的前体，这两种生物分子参与抗凝血，抵抗细菌和病毒的进入，并在血管生成，炎症和癌症的发展中发挥着重要作用，因此生产肝素前体是制备生物工程肝素的第一步。

肝素首先从动物肝脏中而得名，主要从牛肺和猪小肠中提取。2008年美国发生的肝素钠污染事件使得肝素的安全生产备受关注。化学酶法合成肝素是利用肝素前体制备有活性的肝素。目前大肠杆菌K5、D型多杀型巴斯德杆菌和副鸡禽杆菌等的荚膜中被发现，大肠杆菌K5是一株致病菌，在生产使用过程中存在风险。大肠杆菌Nissle 1917(EcN)是一株益生菌，其血清型为O6:K5:H1，是一株天然产肝素前体又是无毒性安全菌株。

因此有必要探索、构建安全高效的微生物细胞工厂，提高肝素前体的产量和质量。

发明内容

本发明的目的是为了提高肝素前体的产量和质量，从而探索并构建一株高效的菌株用于肝素前体的生产。

为解决上述问题，本发明对工业安全菌株大肠杆菌EcN(EshcherichiacoliNissle 1917)进行改造，进一步将肝素前体合成途径中的关键基因galU、ugd和glmS、glmM以及glmU进行组合优化，促进肝素前体在重组EcN中的积累表达。大幅度提高了肝素前体的产量。

本发明提供了重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组菌表达葡萄糖-1-磷酸尿酰胺转移酶GalU、UDP-葡萄糖脱氢酶Ugd、谷氨酰胺-果糖-6磷酸氨基转移酶GlmS、磷酸葡萄糖变位酶GlmM和UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶GlmU中的一个或多个，并同时表达β-UDP-葡萄糖醛酸糖基转移酶KfiC和α-UDP-N-乙酰葡萄糖胺糖基转移酶KfiA。

在一种实施方式中，所述葡萄糖-1-磷酸尿酰胺转移酶GalU来源于枯草芽孢杆菌、兽疫链球菌和/或谷氨酸棒杆菌。

在一种实施方式中，所述葡萄糖-1-磷酸尿酰胺转移酶GalU来源于Bacillussubtilis 168、Streptococcus equi zooepidemicus ATCC 35246和/或CorynebacteriumglutamicumATCC13032。

在一种实施方式中，来源于Bacillus subtilis 168的GalU的Gene ID:936797；来源于Streptococcus equi zooepidemicus ATCC 35246的GalU的Gene ID:7693978；来源于Corynebacterium glutamicumATCC13032的GalU的Gene ID:58311407。

在一种实施方式中，所述UDP-葡萄糖脱氢酶Ugd来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌。