[发明专利]一种通过线粒体标记快速鉴别油松种群的方法

说明书

本发明公开了一种通过线粒体标记对油松种群进行快速鉴别的方法，主要涉及nad7‑1区域PCR扩增的特异性标记引物，以及利用该引物对油松种群进行快速鉴别的方法，所述引物序列为：上游引物：5’‑GAGGGACAACCCTGGAATA‑3’；其下游引物：5’AAGGCCTCTCCATTTCCAAT‑3’。采用本发明方法，利用本发明引物，可知是否具有此分子标记，并可快速、高效并且低成本鉴定油松种群。

技术领域

本发明属于植物分子鉴定技术领域，尤其涉及一种通过线粒体标记鉴别油松种群的方法。

背景技术

油松Pinus tabulaeformisCarr是我国特有并且是中国北方的主要针叶林树种，是我国北方广大地区最主要的造林树种之一，有着重要的生态和经济价值。为了使其能够在分布区稳定、健全地发展，其遗传改良研究工作一直处于有序开展状态，主要集中在种源试验，苗木繁育，造林技术，树木生理等方面。但是长期的野外实验和观察，耗时长也耗费人力物力。

另一种互补的方法是通过分子标记技术来鉴定种源，了解不同地理分布的油松的遗传变异。利用分子标记技术研究油松种质资源多样性也已有很多报道和研究，但是多集中在讨论油松的谱系遗传结构和分化历史。并且线粒体标记nad1-2、nad4-3和nad5-1，以及叶绿体基因片段rpl16和trnS-trnG反映的遗传变异水平低，其中nad1,nad4,nad5线粒体片段单独使用时只有2-4个单倍型，将这三个片段联合起来使用一共才有10个单倍型。分辨率低信息量小，很难定位古油松的起源地。相对的，简化基因组测序技术得到的核基因组提供的遗传变异的数据虽然分辨率高，但是测序经费相对较高，对数据分析也有较高的技术要求。

基于我们在油松的线粒体nad7区域发现了高变异水平，约是线粒休nad1,nad4,nad5片段单倍型总和的两倍，且分辨率达到基因组的水平，可以鉴定中国19个不同来源的油松种源的母本来源，却比基因组测序更加高效且低成本。

本发明应用线粒体nad7区域的分子标记，提供了一种分辨率高、快速且成本低的油松种源鉴定方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供油松线粒体nad7区域的PCR特异性扩增引物；本发明所要解决的另一技术问题是油松线粒体的nad7区域PCR扩增特异性引物的应用，具体涉及一种检测试剂盒。

本发明解决第一个技术问题采用的技术方案为：

用于鉴别油松种群的线粒体标记特异性引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，即：5’-GAGGGACAACCCTGGAATA-3’；其下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，即：5’AAGGCCTCTCCATTTCCAAT-3’。

一种利用上述引物通过线粒体标记快速鉴别油松种群的方法，其特征在于：所述方法包括下列步骤：油松样品中的总DNA的提取；PCR扩增；PCR产物电泳及染色，根据电泳结果判别油松种。

油松总DNA提取方法，针叶保存在-20℃用以提取植物总DNA。采用天根N96植物总DNA提取试剂盒提取DNA。

所述PCR扩增，其PCR反应体系为：25μL的PCR反应体系中包括提取的DNA溶液1μL,10nmol/L上游引物1μL、10nmol/L下游引物1μL，2.5mmol/L dNTP2μL,10×PCR buffer2.5μL,TaqDNA聚合酶1U；

PCR反应程序为：98℃预变性3min，94℃变性30秒，69℃退火30秒，72℃延伸10分钟，变性、退火、延伸三个步骤循环30次；最后再72℃延伸3min。

所述PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，形成特定的单倍型条带。根据单倍型条带的长度即可油松种源进行鉴定。

本发明还提供了一种油松种源快速鉴定试剂盒，所述的试剂盒包含上述引物对。