[发明专利]一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF‑HSA融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT‑MFα‑bFGF‑HSA的构建；(2)bFGF‑HSA融合蛋白工程菌的制备、转化；(3)INVSc1/pYES2/CT‑MFα‑bFGF‑HSA工程菌的诱导表达和纯化。同时还提供了一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF‑HSA融合蛋白标准品的制备方法。本发明利用酿酒酵母表达的长效重组人bFGF与HSA融合而成的重组蛋白(bFGF‑HSA)，生产工艺简单、成本低、产物均一。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法。

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，是成纤维细胞生长因子蛋白(fibroblast growth factors，FGFs)家族中的一员。bFGF是存在于哺乳动物和人体中的一种十分微量却有较多生物功能活性的物质，也因其所具有的广泛生理功能和非常重要的临床应用价值，被国内外研究人员所偏爱。bFGF可以刺激机体中新生血管的生成，也可在创伤愈合的过程中发挥作用，还可以促进组织的再生与胚胎组织的发育和分化，帮助机体组织进一步发育完善。除此之外，还发现其与肿瘤的发生和发展休戚相关。跟据近年的科研成果来看，重组人bFGF已被广泛应用到临床领域，主要用于治疗机体组织创伤或者与神经系统等相关的疾病。

bFGF主要分布于垂体、视网膜等组织中。由于起始位点不同，bFGF在人体内形成不同大小蛋白。目前发现的bFGF就有4种不同大小蛋白，但主要活性成分为分子量约17.2kDa大小的蛋白，由154个氨基酸组成。bFGF是内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞等细胞的促有丝分裂原，在伤口的愈合，组织再生过程中起着重要作用。

早在九十年代，SatoH等科学家就证明了在消化道溃疡中，bFGF能快速修复受损上皮细胞。Matsuura M等在DSS诱导的结肠炎模型中显示通过直肠给药，随着给药量的增加，UC小鼠的肠上皮组织越接近正常小鼠的肠上皮组织，但文献并未详细报道bFGF的治疗机制。而近期研究揭示了bFGF治疗溃疡性结肠炎相关的分子机制。在溃疡性结肠炎初始阶段，bFGF表达量低，而在肠上皮修复阶段，体内的碱性成纤维生长因子上升，加强“正常”血管生成，并且能直接影响上皮细胞及其基质层干细胞增殖、分化，修复损伤上皮组织。经过深入一步研究显示，bFGF还能上调p27肿瘤抑癌基因的表达，通过调节细胞周期，在细胞周期抑制和增殖间达到一个新的平衡，防止在溃疡性结肠炎治疗期间细胞过度增殖。在慢性溃疡性结肠炎中，bFGF能显著下调TNF-α等促炎因子表达和MPO活性，提示bFGF在治疗中可能起到抗炎作用。虽然有研究报道，在许多肿瘤中，bFGF可能是一个潜在的癌症标记物，如大肠癌、乳腺癌、肺癌等。但目前研究尚不清楚bFGF是否参与溃疡性结肠炎癌变的发生发展机制。

由于动物和人体内正常组织中含碱性成纤维因子量极少，而且bFGF在体外极容易失效，远不能满足实际需要。目前许多机构相继利用细菌、病毒等系统实现了bFGF蛋白的高效表达。重组bFGF蛋白质的生产主要依靠大肠杆菌及酵母菌表达系统，临床上使用的“扶济复”、“盖扶”就是利用大肠杆菌基因工程菌表达提纯的bFGF蛋白。但利用大肠杆菌表达后的蛋白需要经超声碎菌后从菌液中提纯目的蛋白。这种传统方法生产的重组人bFGF纯品成本较昂贵，提纯步骤复杂，蛋白在溶液中很不稳定，静置后极易形成二聚体、多聚体，或者出现明显的絮状沉淀，严重影响蛋白质的活性。而利用病毒载体表达bFGF却潜在病毒变异、基因整合等一系列安全问题。