[发明专利]一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法

权利要求书

1.一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA的构建，具体包括：

人碱性成纤维细胞生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pMD19-T-bFGF-HSA；

对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-bFGF-HSA进行双酶切，并分别切胶回收bFGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接，经含氨苄青霉素的LB平板培养基筛选获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA；

(2)bFGF-HSA融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：

酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；

将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA电转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA；

(3)INVSc1/pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA工程菌的诱导表达和纯化，具体包括：

将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA，通过培养、诱导表达，再依次经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化，即得本发明所需酿酒酵母表达重组人bFGF-HSA融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，人碱性成纤维细胞生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pMD19-T-bFGF-HSA，具体步骤为：

根据pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计了重组人bFGF-HSA基因序列和重组人bFGF-HSA的氨基酸序列，重组人bFG F-HSA基因序列如序列表1所示，重组人bFGF-HSA的氨基酸序列如序列表2所示；

将序列以bFGF-HSA顺序插入pMD19-T Simple Vector，其5’端接NotⅠ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-bFGF-HSA。

3.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-bFGF-HSA进行双酶切，并分别切胶回收bFGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接，获得阳性克隆pYE S2/CT-MFα-bFGF-HSA，具体步骤为：

用内切酶Not I和内切酶Xba I分别对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-bFGF-HSA进行双酶切；

在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收bFGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接；

将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄青霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR及双酶切鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-bFGF-HSA。

4.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人bFGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：

YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，121℃高压灭菌20min；

SC-U选择培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸(制备SC-U选择性平板培养基时另加20g琼脂粉)，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；

SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。