[发明专利]用于血液样本荧光PCR的免提取试剂及其应用

说明书

一种用于血液样本荧光PCR的免提取试剂，具体包括：血液稀释液和PCR反应液，该免提取试剂与血液样品构成PCR反应体系，其中，血液稀释液中醇类物质为PEG200，碱性物质为NaOH；且血液稀释液中各物质在血液稀释液中的浓度分别为：PEG200含量为0.01wt％～0.1wt％，NaOH含量为10mM～100mM，Tris‑HCl含量为5mM～50mM，Tween类非离子型表面活性剂含量为0.1wt％～1wt％。本发明中的免提取试剂能够获得预料不到的体系稳定性和降低血液中抑制物干扰能力，提升了测试结果的准确性，其中免提取试剂能够使得血液中各种抑制物充分变性，后续PCR体系对抑制物的耐受能力得到有效提升。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体而言，本发明涉及适用于Taq man SNP分型的血液直接荧光PCR扩增的免提取试剂和应用方法。

背景技术

近年来，荧光PCR技术以其快速、准确、简便的特点，在临床及检验检疫等领域得到了越来越广泛的应用。Taq man SNP分型技术是荧光PCR技术的重要应用之一，广泛应用于病原体耐药突变检测、遗传病检测、优生优育、肿瘤靶向药物靶点检测等方面，已经成为分子诊断和临床检验的一种重要技术手段，并且在临床得到了广泛的推广。

人类基因组DNA是临床Taq man SNP分型检测的一种重要的分析样本，血液是其临床常用的重要生物来源。而血液中含有大量的DNA聚合酶抑制物，如血红素、蛋白质、脂肪等，会严重干扰PCR检测的准确性，故为了可以进行Taq man SNP分型检测，现有技术往往采用先对血液中的核酸进行提取和纯化，再进行PCR检测的方式，如酚-氯仿提纯法、柱纯化法、磁珠分离法等，都是现有常用的血液基因组DNA提取方法。虽然这些方法可以获得高纯度的DNA，但同时具有DNA损失大、操作繁琐、容易交叉污染等弊端。即使经过改进和操作步骤的精简，但操作中使用的提取试剂也会影响荧光PCR的效果，对操作者而言仍然需要离心、转移等多次操作才能完成，操作过程相对复杂，存在交叉污染的风险。

现有技术中研发人员开发出了可以用于直接PCR检测的免提取试剂。例如CN103305499B公开了一种直接扩增试剂，该直接扩增试剂1a由20mmol Tris-HCl，1.6mMMgCl₂，200uM each dNTP，50mM KCl，25mM NH₄Cl，1200ug/ml BSA，0.2％(体积百分含量)辛基苯基-聚乙烯二醇，0.2％(体积百分含量)N-辛酰基-N-甲基葡糖胺，5％(质量百分含量)PEG6000，0.3U/μl GoldTaq DNA聚合酶和水组成。将该直接扩增试剂和引物加入到血卡样本中，进行测试，实现了免提取荧光PCR测试的目的，其中当PEG6000的浓度达到4.5％-5.5％的范围内时可以获得稳定系统的效果。该现有技术采用STR分型荧光PCR获得检测结果。由于SNP分型荧光标记相比于STR分型荧光标记，具有特异性高、结果更加可靠的技术效果，相应地对于样品中抑制物质干扰的排除、反应体系的稳定性等要求也更高。

另外，现有技术CN109402239A公开了一种用于实时荧光定量PCR的免提取直接扩增试剂，用于呼吸道分泌物等非血液样本中核酸检测，而本领域中不同类型样本中的抑制物质种类差异性极大，将该现有技术中使用的试剂用于血液中DNA进行Taq man SNP分型检测，结果存在准确率不高的问题，可能是由于血液中干扰物质多、含量高，导致抑制物质不易有效变性造成。

为了解决以上问题，本发明期待建立一种能够适用于Taq man SNP分型的血液直接荧光PCR扩增的免提取试剂，以获得操作过程简单、并检测结果的技术效果。

发明内容

基于现有技术存在的技术问题，本发明提供一种用于血液样本荧光PCR的免提取试剂，具体包括：血液稀释液和PCR反应液，该免提取试剂与血液样品构成PCR反应体系，其中，

血液稀释液包括：醇类物质，碱性物质，Tris-HCl,Tween类非离子型表面活性剂；