[发明专利]一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法

说明书

一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法，构建表达D‑乳酸和L‑乳酸的乳酸脱氢酶同工酶基因的重组大肠杆菌，进行摇瓶培养发酵，结合摇瓶发酵和乳酸的测定，检测好氧培养及厌氧培养时重组大肠杆菌的D‑乳酸、L‑乳酸的生成情况，判断不同乳酸脱氢酶同工酶是否具有催化活性，该方法能快速、准确判鉴定保加利亚乳杆菌中不同的乳酸脱氢酶同工酶在乳酸合成中的作用。

技术领域

本发明属于酶活性鉴定技术领域，具体涉及一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法。

背景技术

乳酸是一种重要的生物基平台化合物，广泛应用于农业、食品、医药、化工和环保等领域。根据其旋光性的不同可分为D-乳酸和L-乳酸，分别由D-乳酸脱氢酶(D-LDH，EC1.1.1.28)和L-乳酸脱氢酶(L-LDH，EC 1.1.1.27)催化。

乳酸菌细胞内乳酸脱氢酶的立体特异性决定了形成乳酸的立体构型，如Lactobacillus delbrueckii、L.bulgaricus、L.jensenii和L.coryniforis发酵产物以D-乳酸为主，有的菌株含有两种乳酸脱氢酶或存在乳酸消旋酶，最终形成DL-乳酸。而有些乳酸菌产生的是L-乳酸，当L-乳酸积累时，则诱导产生乳酸消旋酶，该酶将L-乳酸转变为D-乳酸，直至平衡。

有研究显示，改变pH值或营养物质，D-乳酸或L-乳酸的比例将发生变化。对于合成D-乳酸的乳酸菌来说，D-LDHs具有较L-LDHs更高的丙酮酸催化效率。采用D-LDHs或者L-LDHs生物转化丙酮酸可产生有光学特性的D-乳酸或者L-乳酸。

通过过量表达ldhD或ldhL基因，在合适的宿主中高效表达来实现相应构型乳酸产量的提高。杨登峰等(产高纯度L-乳酸大肠杆菌基因工程菌的初步研究[J].现代食品科技，2010，26：126-128)在大肠杆菌中过量表达来源于L.rhamnosus的ldhL基因，成功生产获得纯度为99％的L-乳酸； Zhou等(Functional replacement of the Escherichia coli D-(-)-lactate dehydrogenase gene(ldhA)with the L-(+)-lactate dehydrogenase gene(ldhL) from Pediococcus acidilactici[J].Appl Environ Microbiol，2003，69： 2237-2244)通过将乳酸片球菌Pediococcus acidilactici的L-LDH基因ldhL 替换大肠杆菌中的D-LDH基因ldhA，从而得到的工程菌SZ85可生产得率为95％的高化学纯的L-乳酸。Okano等(Efficient production of optically pure D-Lactic acid from raw corn starch byusing a genetically modified L-Lactate dehydrogenase gene-deficient andα-amylase-secreting Lactobacillus plantarum strain[J].Appl Environ Microbiol,2009,75: 462-467)敲除L.plantarum NCIMB 8826的ldhL基因，表达来自牛链球菌Streptococcus bovis148的α-淀粉酶基因，得到的工程菌可有效利用淀粉合成高纯度的D-乳酸。

然而，对于保加利亚乳杆菌中不同的乳酸脱氢酶同工酶的作用鉴定，目前尚无系统研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法，通过构建表达乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌，判断有氧和厌氧发酵时重组菌的D-乳酸、L-乳酸的生成情况，快速、准确判鉴定保加利亚乳杆菌中不同的脱氢酶同工酶在乳酸合成中的作用。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法，包括以下步骤：