[发明专利]一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法

权利要求书

1.一种保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法，包括以下步骤：

1)菌株培养

将保加利亚乳杆菌ATCC11842菌液接种于3～5mL MRS培养基中，37℃静置培养48～72h；

将大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种于3～5mL LB培养基中，37℃，180～220r/min培养10～12h，获得E.coliBL21感受态细胞；

2)构建重组大肠杆菌

根据Genbank中Lactobacillus bulgaricus ATCC11842 D-乳酸脱氢酶的基因序列ldb_rs00400、ldb_rs04425和1db_rs03465，L-乳酸脱氢酶的基因序列ldb0120和ldb0094，分别设计特异性引物，以保加利亚乳杆菌基因组为模板，进行PCR扩增，获得相应的目的片段；

采用NheI和XhoI限制性内切酶分别对各目的片段及载体pET28a进行双酶切，胶回收纯化后采用T4 DNA连接酶将酶切后的目的片段和线性化载体pET28a进行连接，其中，目的片段与线性化载体pET28a的质量浓度比为1：3～5；将连接产物42℃热激转化到E.coliBL21感受态细胞，复苏后涂布LB平板，筛选重组大肠杆菌转化子；

挑单菌落至终浓度为30～50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10～12h，进行菌液PCR验证，测序，获得重组大肠杆菌；

3)摇瓶发酵

以空质粒重组菌E.coli/pET28a作对照，对表达D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶同工酶基因的五种重组大肠杆菌，分别进行好氧培养和厌氧培养；

将重组大肠杆菌种子按照0.5～2％的接种量接种于M9发酵培养基中，分别进行好氧发酵和厌氧发酵，添加终浓度为0.1～0.5mmol/L IPTG进行诱导；好氧培养时，用纱布包裹培养容器瓶口；厌氧培养时，装液量接近满瓶，容器封口培养；

其中，培养菌液中添加终浓度为30～50μg/mL的卡那霉素，35～38℃，180～220r/min，发酵时间为18～24h，测定菌体浓度OD600，测定D-乳酸和L-乳酸的浓度。

2.根据权利要求1所述保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中涉及的引物序列如下：

ldb_rs00400基因：

F：5’-CCGCGCTAGCATGACTAAAATTTTTGC-3’；

R：5’-GCTTCTCGAGTTAGCCAACCTTAACTGG-3’；

ldb_rs04425基因：

F：5’-GGCGGCTAGCATGACTAAAATTGCCAT-3’；

R：5’-CACGCTCGAGTTACAGGTTAACGATGCT-3’；

ldb_rs03465基因：

F：5’-ACTAGCTAGCATGTACCTCTTGCGC-3’；

R：5’-CGACCTCGAGTTACTGCTTTTTCGCTAA-3’；

ldb0120基因：

F：5’-CCGAGCTAGCATGAGTAGAAAAGTCC-3’；

R：5’-CGGGCTCGAGTTATCCTAAAGAGTCC-3’；

ldb0094基因：

F：5’-CGGAGCTAGCATGAGAAAAGTAGCAG-3’；

R：5’-CGGTCTCGAGTTATTCCAAGCTGGCC-3’。

3.根据权利要求1所述保加利亚乳杆菌乳酸脱氢酶同工酶作用类型的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，52～55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。