[发明专利]一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺

权利要求书

1.一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1、样品菌液的制备：将乳酸菌来源样品剪碎、研磨，转入装有9mL无菌水或生理盐水的离心管中，涡旋或摇床震荡混匀10-30min，即稀释10^-1的样品液，继续将样品稀释至10^-3,10^-4和10^-5中；

S2、乳酸菌菌落的培养：分别吸取步骤S1中10^-3,10^-4和10^-5样品液0.2mL，涂布在MRS琼脂培养基上按每个梯度3个平板进行操作，在温度为37℃下培养24-48h，得到所需的乳酸菌菌落；

S3、染色和划线操作：将步骤S2中培养的乳酸菌菌落中挑取有透明圈的菌落，进行革兰氏染色，将G+在MRS琼脂板上划线，37℃培养24h，重复1-2次，直至得到纯菌落，实现；

S4、菌落的第一次活化：将步骤S3中制备的乳酸菌放入实验室冰箱中进行保藏操作，将乳酸菌用100ml灭菌的MRS液体培养基进行第一次活化，活化温度37℃，24h后平板检测纯度和活菌数；

S5、菌落的第二次活化：将步骤S4中100ml菌液全部转入至400ml灭菌MRS液体培养基进行第二次活化，24h后平板检测纯度和活菌数，检测达标后转至40L发酵罐中进行扩大培养48h；

S6、活菌数的测定：将步骤S5中活化、扩培后的菌种，接入MRS液体培养基培养，待测活菌数时，取0.5mL发酵液加入至4.5mL灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取10^-8,10^-9和10^-10三个稀释倍数，吸取0.2mL稀释液注入无菌培养皿中，倾注法加入15mL左右的计数培养基混匀，每个稀释度做三个平行培养皿；

S7、恒温培养箱培养：将步骤S6培养基凝固后，倒置放入37℃恒温培养箱中，培养48h，选取菌落数在30-300之间的培养皿计菌落数；

S8、离心收集菌泥：利用超速离心机对步骤S7中发酵后的菌液进行离心操作，在转速为4000-6000r/min的条件下离心10min，去上清收集沉积物；

S9、菌泥冷冻干燥：将步骤S8中收集到的沉积物加入至复配保护剂，用振荡器混匀，制成菌悬液，将制备的菌悬液盛入冷冻平皿中，随后先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min，然后置-80℃冰箱60min，再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥14h，密封保存于4℃冰箱中，实现菌泥的冷冻干燥处理；

S10、冻干粉的制备：将步骤S9制备的菌泥进行纯度检测，检测完成后，进行真空-充氮研磨操作以及包装处理，即得到所需的乳酸菌冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S3中制备的纯菌落需要通过镜检、形态学分析、16srRNA测序等鉴定。

3.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S2中的MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三氨1g、乙酸钠5g、硫酸镁0.8g、硫酸锰0.25g以及吐温80ml。

4.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S2中的MRS琼脂培养基的PH值为6.2-6.4，用蒸馏水定容至1000ml，在115-120℃下灭菌25-35min。

5.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S9中的复配保护剂的组成成分为50g/L甘露醇和100g/L奶粉，并提前用蒸馏水配置待用。

6.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S9中真空冷冻干燥条件设置为冻干仪腔体温度为-60℃至-70℃，压力为0.005至0.006Pa，时间为13-14h。

7.根据权利要求1所述的一种乳酸菌冻分离和干粉制作工艺，其特征在于，所述步骤S8中的离心操作是在高速离心机下进行操作。