[发明专利]一种纳米孔全长转录组文库构建方法

说明书

本发明涉及转录组测序技术领域，具体涉及一种纳米孔全长转录组文库构建方法。本发明的文库构建方法包括：将mRNA富集后，采用SMART技术将mRNA反转录制备cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行FFPE和末端修复，再连接纳米孔测序接头。该方法利用SMART技术构建全长转录组文库，文库可用于纳米孔测序，对于读长没有上限的限制，不需要进行长度选择，无需拼接，整个转录本可以进行单读长的端到端测序，可实现简单、准确的组装，并能区分高度相似的异构体、识别新转录本以及检测融合。

技术领域

本发明涉及转录组测序技术领域，具体涉及一种纳米孔全长转录组文库构建方法。

背景技术

真核细胞的mRNA的3’末端都带有一段PolyA，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是，由于cDNA的5’末端序列各不相同，获得cDNA全长序列存在较大的困难，SMART(Switching Mechanism At 5’end of the RNA Transcript)技术的出现解决了该问题。SMART(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template)技术的原理是在合成cDNA的反应中事先加入3’末端带Oligo(dG)的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5’末端时遇到真核mRNA特有的帽子结构，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个C，SMART引物的Oligo(dG)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于具有5’帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。

转录组是给定细胞中存在的所有RNA分子的集合，可以通过高通量技术来确定，例如微阵列分析或RNA测序(RNA-seq)方法。使用NGS技术，RNA-seq已取代微阵列分析，因为前者可以检测到新的或未知的转录本。此外，与微阵列相比，NGS能够以更高的表达水平动态范围进行转录组分析。随着样品制备方法的改进和测序成本的降低，NGS的RNA seq已成为分析转录组的首选方法。大多数NGS平台生成的单个reads的长度范围从35nt到大约500nt，因此单个reads很少覆盖完整的转录本，平均而言，细菌大约有1000个核苷酸，并且在真核生物中更长。这种短序列的准确比对和组装取决于参考基因组的可用性。转录本的剪接、mRNA的编辑或基因融合转录本的鉴定仍然是一个挑战。与二代测序相比，纳米孔(nanopore)全长转录组测序具有没有读长上限的限制，不需要进行长度选择，整个转录本可以进行单读长的端到端测序等优势，实现了简单、准确的组装，并能够区分高度相似的异构体、识别新转录本以及检测融合。

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米孔全长转录组文库构建方法。

为实现上述目的，本发明将SMART技术和ONT纳米孔测序技术相结合，开发基于SMART和ONT测序技术的覆盖全长转录组的文库构建方法，该方法利用SMART技术获得全长转录组，再连接纳米孔测序接头得到待测序的文库样本，该文库样本可用于纳米孔三代测序。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种纳米孔全长转录组文库构建方法，该方法包括：将mRNA富集后，采用SMART技术将mRNA反转录制备cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行FFPE和末端修复，再连接纳米孔测序接头。

具体地，mRNA富集为利用mRNA的3’端存在PolyA尾进行mRNA的调取。优选采用偶联Oligo dT的磁性微球，特异地靶向捕获初始样品中的polyA RNA，实现从总RNA中富集得到mRNA。