[发明专利]一种纳米孔全长转录组文库构建方法

权利要求书

1.一种纳米孔全长转录组文库构建方法，其特征在于，包括：将mRNA富集后，采用SMART技术将mRNA反转录制备cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行FFPE和末端修复，再连接纳米孔测序接头。

2.根据权利要求1所述的纳米孔全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述反转录的引物包括VNP引物和SSP引物，所述VNP引物具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SSP引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的纳米孔全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述反转录的反应体系中，所述VNP引物与所述SSP引物的终浓度之比为1:(5-10)；

优选地，所述反转录的反应体系中，所述VNP引物的终浓度为0.06-0.15μM，所述SSP引物的终浓度为0.6-0.7μM。

4.根据权利要求2～3任一项所述的纳米孔全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述反转录的反应条件为：50℃，10min；42℃，10-15min；80℃，10min。

5.根据权利要求1～4任一项所述的纳米孔全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的引物的序列如SEQ ID NO.3-4所示；

优选地，所述PCR扩增的反应条件为：95℃，30sec；95℃，15sec，62℃，15sec，65℃，6-9min，15-20个循环；65℃，5-10min。

6.根据权利要求1～5任一项所述的纳米孔全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述FFPE和末端修复的反应条件为：20℃，14-16min；65℃，4-6min。

7.根据权利要求1～6任一项所述的纳米孔全长转录组文库构建方法，其特征在于，所述纳米孔测序接头为ONT Adapter Mix；

优选地，所述连接纳米孔测序接头的60μL反应体系包括如下组分：FFPE和末端修复纯化产物300-500ng，ONT LBN连接buffer25μL，ONT Adapter Mix测序接头5μL，T4 DNA连接酶10μL，水补足至总体积；

更优选地，所述连接纳米孔测序接头的反应条件为：22-25℃反应30-45min。

8.用于SMART技术反转录的引物，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列。

9.一种纳米孔全长转录组测序方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1～7任一项所述的纳米孔全长转录组文库构建方法构建全长转录组文库，以及，以所述全长转录组文库为对象进行测序。

10.根据权利要求9所述的纳米孔全长转录组测序方法，其特征在于，所述测序利用纳米孔测序平台进行。