[发明专利]一种基于ddPCR定量检测ALK、RET和ROS1融合基因的试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于ddPCR定量检测ALK、RET和ROS1融合基因的试剂盒，该试剂盒包括阴性对照品，阳性对照品，PCR反应液Ⅰ，PCR反应液Ⅱ。本发明提供一个基于ddPCR的RT‑PCR定量检测体系，包含了针对融合基因EML4‑ALK、CCDC6‑RET、CD74‑ROS1以及内控基因TBP的正、反向引物和荧光探针。本试剂盒通过在5’伙伴基因上设计正向引物，在3’驱动基因上设计探针和反向引物来检测ALK、RET和ROS1融合基因，检测结果用单位体积内拷贝数表示。通过ddPCR检测方法，可以简单快速地检出临床样本中是否发生了EML4‑ALK、CCDC6‑RET和CD74‑ROS1的融合，为ALK、RET和ROS1相关肿瘤疾病的诊断、分型、临床治疗和预后判断提供了重要依据，为临床治疗提供新的思路。

技术领域

本发明属于核酸体外诊断试剂领域，特别涉及一种基于ddPCR定量检测ALK、RET和ROS1融合基因的试剂盒。

背景技术

肿瘤的发生和发展是一个多基因参与的复杂生物学过程。随着肿瘤分子病理学和分子遗传学研究的深入，医学界对肿瘤的认识已经从传统意义上的一种疾病转变成一组由基因驱动的疾病。基因融合是实体和血液恶性肿瘤重要的癌基因，ALK、RET和ROS1原癌基因在实体肿瘤的发生中起着非常重要的作用，ALK、RET和ROS1融合基因的检出给分子精准治疗带来了新的希望。

ALK基因编码胞内酪氨酸激酶信号受体，位于2号染色体短臂上，含29个外显子，蛋白全长1620个氨基酸，参与调控细胞增殖的信号通路，不受控时会导致癌症的发生。ALK基因融合为其最常见的突变，它是一个较强的致癌驱动基因。EML4-ALK是在非小细胞肺癌(NSCLC)中发现的第一个融合基因激酶抑制靶点，在NSCLC患者中的发生率为3-5％，EML4-ALK融合可能与多种实体瘤相关。EML4-ALK亚型决定于两者的断裂连接位置，ALK常见的断裂点为外显子20和外显子19。ALK外显子20易于EML4发生融合，常见的EML4发生融合的外显子为13，在所有突变频率中占比24.61％(Cosmic)。此外，依据突变频率高低，EML4-ALK(exon 20)融合形式还依次包括了EML4的6、20、18、2、15、14、17外显子。

ROS1基因位于染色体6q16-22上，编码长2347氨基酸的蛋白质，是一个与ALK无关的受体。但ROS1和ALK高度同源，因此ALK抑制剂(例如克唑替尼)对ROS1阳性的NSCLC患者同样有效。ALK基因与其它基因发生融合时会保留激酶结构域，在断点上较为保守。ROS1重排会导致激酶持续激活，上调信号通路，导致细胞持续增值，直至肿瘤发生。ROS1重排在各种实体瘤中陆续发现。CD74-ROS1融合基因是2007年在肺癌细胞系中首次发现的，ROS1融合基因在NSCLC中发生率约为0.7-1.7％。在2012年ASCO年会上Shaw报道了ROS1重排阳性的NSCLC患者在接受克唑替尼治疗后肿瘤明显缩小。

RET癌基因发现于1985年，定位于染色体10q11，含21个外显子，全场60kb，编码跨膜酪氨酸激酶受体，与ALK有37％氨基酸相同。RET配体有胶质源性神经营养因子家族，受体二聚化和激酶域自身磷酸化激活RET，下游信号通路，与细胞的增值、迁移和分化有关。RET酪氨酸激酶活性的异常活化，促进了肿瘤的发生。RET基因重排是在肺腺癌中发现的，研究发现大于90％的甲状腺癌中存在有RET基因重排。RET基因发生重排的外显子有8、10、11、13、14、15，16。有结果研究表明RET融合基因在NSCLC中表达率约为0.9％，在肺腺癌中约为1.2-1.9％。2018年9月，Loxo Oncology官宣LOXO-292用于治疗携带RET基因变异的NSCLC和甲状腺髓样癌(MTC)患者。带有RET融合基因变异的NSCLC患者，LOXO-292的总体缓解率为77％；在甲状腺髓样癌中，总体缓解率为45％。