[发明专利]动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法

说明书

本发明涉及的是动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，它在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的四种致病菌，四种致病菌为大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌；具体包括：步骤一、待检食品样品处理；步骤二、设计PCR引物，建立多重PCR扩增的PCR反应体系；步骤三、多重PCR检测，将多重PCR扩增的PCR反应体系进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，进行检测是否存在大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌。本发明四种细菌多重PCR检测灵敏度在10³~10⁶ cfu/mL。

一、技术领域：

本发明涉及食品检测领域，具体涉及的是动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法。

二、背景技术：

细菌性食物中毒占我国食物中毒总数的首位，动物性食品是引起细菌性食物中毒的主要原因。目前对食品中致病菌检测的方法以微生物常规培养法为主，需要3~7天，操作繁琐，所用试剂复杂多样，费用很高，不能满足实际商品流通需要。PCR（聚合酶链式反应）技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速的特点，使用PCR技术检测食品中致病菌的研究方兴未艾。大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌是污染动物性食品的四种重要的致病菌。

三、发明内容：

本发明的目的是提供一种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，这种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法用于解决现有技术中食品中致病菌检测的方法操作繁琐，所用试剂复杂多样，费用很高的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法是在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的四种致病菌，四种致病菌为大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌；具体包括如下步骤：

步骤一、样品处理：

取待检食品样品1g(mL)加入到9 mL灭菌LB液体培养基中37℃，120r/min振荡培养， 6 h后，取1mL培养液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，作为多重PCR检测模板；

步骤二、建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：

2.1 PCR引物设计：PCR扩增菌特异靶基因的选用：大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly，小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail，荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX；

根据大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：

上游引物eaeA-s2：CACCAGAGGAATCGGAGTA （SEQ ID NO:1）

下游引物eaeA-a2：CTGAAAGCGAAATGATGAAG （SEQ ID NO:2）

根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：

上游引物hly-s1：TTCGGCAAAGCTGTTACTA （SEQ ID NO:3）

下游引物hly-a1：GGCAAATAGATGGACGATG （SEQ ID NO:4）

根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物，并组成第三对引物：

上游引物ail-s1：TGAAGTACCGTTATGAACTCG （SEQ ID NO:5）

下游引物ail-a1：TGACTTAACCTTTCCGTGAG （SEQ ID NO:6）