[发明专利]动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法

权利要求书

1.一种动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于：在LB培养基通用增菌后的6h内一步同时检测食品中污染的四种致病菌，四种致病菌为大肠埃希氏菌O157：H7、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和荧光假单胞菌；具体包括如下步骤：

步骤一、样品处理：

取待检食品样品1g或1mL加入到9 mL灭菌LB液体培养基中37℃，120r/min振荡培养， 6h后，取1mL培养液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，作为多重PCR检测模板；

步骤二、建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：

2.1 PCR引物设计：PCR扩增菌特异靶基因的选用：大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly，小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail，荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX；

根据大肠埃希氏菌O157：H7的紧密黏附素基因eaeA的特异位点设计两条特异引物，并组成第一对引物：

上游引物eaeA-s2：CACCAGAGGAATCGGAGTA （SEQ ID NO:1）

下游引物eaeA-a2：CTGAAAGCGAAATGATGAAG （SEQ ID NO:2）

根据单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly的特异位点设计两条特异引物，并组成第二对引物：

上游引物hly-s1：TTCGGCAAAGCTGTTACTA （SEQ ID NO:3）

下游引物hly-a1：GGCAAATAGATGGACGATG （SEQ ID NO:4）

根据小肠结肠炎耶尔森氏菌的粘附侵袭位点基因ail的特异位点设计两条特异引物，并组成第三对引物：

上游引物ail-s1：TGAAGTACCGTTATGAACTCG （SEQ ID NO:5）

下游引物ail-a1：TGACTTAACCTTTCCGTGAG （SEQ ID NO:6）

根据荧光假单胞菌的热休克蛋白基因htpX的特异位点设计两条特异引物，并组成第四对引物：

上游引物htpX-s1：TTCTGTGCGGTCTTTGGT （SEQ ID NO:7）

下游引物htpX-a1：AGGTAGTAGGCGATGC （SEQ ID NO:8）

2.2建立多重 PCR扩增的PCR反应体系：

多重PCR扩增PCR反应体系包括: 以50μL溶液计,5 μL 10×PCR反应缓冲液, 5µl 浓度为2mM 的dNTP， 5u/μL Taq酶1μL， 4μL多重PCR检测模板，3 μL浓度为25mM 的MgCl₂，浓度为25uM的第一对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第二对上、下引物各为1μL，浓度为25uM的第三对上、下引物各为2μL，浓度为25uM的第一对上、下引物各为2μL，余量为超纯水；

步骤三、多重PCR检测：

将多重 PCR扩增的PCR反应体系进行PCR扩增反应，获得PCR扩增产物，若PCR扩增产物中存在866bp的DNA片段，表明所述待检食品中有大肠埃希氏菌；若PCR扩增产物中存在605bp的DNA片段，表明所述待检食品中有单核细胞增生李斯特氏菌；若PCR扩增产物中存在461bp的DNA片段，表明所述待检食品中有荧光假单胞菌；若PCR扩增产物中存在209bp的DNA片段，表明所述待检食品中有小肠结肠炎耶尔森氏菌。

2.根据权利要求1所述的动物性食品中四种致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的条件为：在PCR仪上进行扩增反应，反应热循环参数为：94℃预变性4min，94℃变性45 s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃延伸4 min。