[发明专利]中药材乳鹿分子身份证快速鉴定方法及检测试剂盒

说明书

本发明涉及中药分子鉴定领域，是一种乳鹿分子身份证快速鉴定方法及检测试剂盒。鉴定方法包括：乳鹿基因组DNA的提取、设计乳鹿mtDNA Cyt b基因的特异性引物、建立PCR反应体系和反应条件、核酸试纸条鉴定乳鹿真伪图谱和结果判定。试剂盒包括：乳鹿基因组DNA提取试剂、乳鹿PCR鉴定试剂、阳性对照DNA克隆液、空白对照液及核酸试纸条。本发明利用乳鹿独一无二的mtDNA Cytb基因序列，设计的特异性引物，利用PCR技术的特异性、灵敏性特点，利用核酸试纸条技术的简便、快速、低成本优势，所建立的鉴定方法能够特异、准确、快速地鉴定乳鹿与其易混品种；所研制的试剂盒能够使鉴定方法更标准化、更规范化。

技术领域

本发明涉及中药分子鉴定领域，使用分子生物学技术建立乳鹿与其易混品种快速鉴定方法及研发快速检测试剂盒。

背景技术

乳鹿为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon(Temminck)或马鹿C.elaphus(Linnaeus)哺乳期的健康干燥幼鹿。乳鹿是国药准字号(Z11020625)中成药乳鹿膏的主要成分，具有补气养血，益肾填精的作用。用于体虚面黄，腰腹冷痛，月经不调，遗精阳痿等症。由于乳鹿来源稀少，药效独特，疗效确切，其市场价格也较高，并且乳鹿又缺乏质量标准。因此市场上大量伪品和混淆品(多为乳猪、牛、乳马、乳羊等)以假乱真现象严重，严重影响着人们的健康安全。

目前，中药材鉴定的常用方法包括基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等传统方法，容易受主观因素及加工炮制的影响。市售乳鹿多为炮制过的干燥品或粉末，很难通过性状或显微鉴定与常见伪品区分开来。而目前乳鹿尚无明确的功效成分或标志性成分，也很难通过理化方法进行鉴定。从分子遗传学角度来说，物种的差异归根结底追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此DNA条形码技术推动中药鉴定方法学从形态限定走向分子鉴定。传统的鉴定方法结合分子鉴定，逐步形成健全的中药材及中成药质量控制体系。

然而，DNA条形码技术基于通用引物和标准的DNA序列，所以DNA序列的完整性是DNA条形码技术技术成败的关键。DNA条形码鉴定必须在适宜的范围内应用。对于经过炮制加工的中药材或饮片(简单切割、低温干燥除外)此法具有局限性。Shaw等的研究结果果表明人参在煎煮两小时后只能扩増获得88bp的短片段，而无法获得121bp及更长的片段。Meusnier研究结果表明短序列适用于标本等已降解材料的鉴定。因此，宋经元题组在对中草药DNA条形码数据库海量数据分析的基础上，创新性的提出应用20-50bp的＂分子身份证＂鉴定药材的方法，通过设计特异引物从中成药中扩増获取含有此分子身份证的Mini-barcode序列，并在西洋参、冬虫夏草、三七中成功应用。

本发明考虑干燥乳鹿样品是经高温烘烤而成，会导致DNA降解严重。因此，自主研发的基因组DNA提取试剂时，尽量简化操作步骤，缩短提取时间，避免物理、化学以及生物因素对基因组DNA的降解，但所提取的基因组DNA质量仍然降解严重，降解成100bp左右小片段，浓度较低但纯度较好。针对降解严重的如基因组DNA，本发明采用分子身份证技术，以乳鹿mtDNACytb基因作为靶基因，设计小片段46bp的特异性引物，在退火温度为57℃的条件下，进行PCR扩增。核酸试纸条检测结果显示，供试品核酸试纸条图谱中，在与阳性对照品核酸试纸条图谱相应的位置上，出现2条条带，空白对照出现一条带。琼脂糖凝胶电泳验证结果显示，成功的扩增出乳鹿的特异性片段。由于扩增DNA片段小于50bp，因此，在进行PCR扩增时，高温变性、低温退火、适温延伸的时间均可以缩短至15秒；并且由于核酸试纸条的灵敏性高于琼脂糖凝胶电泳，因此PCR扩增的循环次数改为20个循环即可。大大节省了乳鹿检测时间，从而建立了乳鹿分子身份证快速纹鉴定方法。