[发明专利]中药材乳鹿分子身份证快速鉴定方法及检测试剂盒

权利要求书

1.一种乳鹿分子身份证快速鉴定方法，其特征在于，它包含以下步骤：

(1)设计并合成标记乳鹿mtDNA Cytb基因特异性引物，引物序列如下(扩增长度为46bp)：

上游引物：5’(FAM)-ATGCTTAGAAGGGATGA-3’

下游引物：5’(Biotin)-TAGGGAGGCTATTACG-3’

(2)乳鹿基因组DNA的提取：

取待测样品粉末0.1g置1.5ml离心管中，加入细胞裂解液500μl，充分混匀，在55℃水浴保温1小时；加到DNA纯化柱中，10000rpm/min离心3min；弃去过滤液，加入漂洗液600μl，10000rpm/min离心1min；弃去过滤液，重复1次；弃去过滤液，再离心2min，将DNA纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入洗脱液100μl，室温放置5-10min后，10000rpm/min离心2min；离心管中即为模板DNA溶液，作为供试品-20℃冰箱中备用。(DNA提取试剂及各种溶剂均为提取0.1g样本时的加入量，根据实际样本量按比例调整)

(3)乳鹿PCR反应体系及反应程序：

乳鹿鉴定反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入供试品DNA模板溶液2μl；

乳鹿阳性对照反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入DNA对照克隆液2μl；

乳鹿空白对照反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入空白对照液2μl；

将总体积为25μl的PCR反应管置于PCR反应仪中，按下列程序进行：94℃预变性5min，94℃15s，退火温度56℃15s，72℃15s，20个循环，72℃延伸10min。

(4)核酸试纸条快速检测PCR产物

取PCR产物取5μl滴加到试纸条(市场有售，可购买)的样品区，然后插入到含有95μl展开缓冲液(与试纸条一起)的试管中，2-3min后即肉眼可见检测结果，并拍照。

(5)结果判定

供试品核酸试纸条图谱中，在与阳性对照品核酸试纸条图谱相应的位置上，出现2条条带，空白对照出现一条带。参照附图1。

2.一种乳鹿DNA分子身份证快速检测试剂盒，其特征在于，它包含：

(1)基因组DNA提取试剂

①细胞裂解液：1mol/L Tris-HCl 1ml，0.5mol/L EDTA 2ml，NaCl 0.58g，10％SDS10ml，20mg/ml蛋白酶K1ml，加双蒸水定容至100ml；RNA酶溶液5μl；

②漂洗液：5mol/L醋酸钾溶液26μl，l mol/L Tris-盐酸溶液(pH值7.5)18μl，0.5mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液(pH值8.0)3μl，无水乙醇480μl，无菌双蒸水73μl；

③洗脱液：灭菌双蒸水。

(2)PCR鉴定试剂

①PCR鉴定反应液：总体系为23μl，含有2×Taq PCR Master Mix(包括Taq DNA Poly、dNTPs、Buffer)12.5μl，上游引物、下游引物(12.5μM)各1μl,灭菌双蒸馏水8.5μl。

②阳性对照DNA克隆液：经过鉴定的正品乳鹿DNA经分子克隆及基因测序，得到的质粒DNA溶液。

③空白对照液：灭菌双蒸馏水。

(3)核酸试纸条检测PCR产物

一次性核酸试纸条及展开缓冲液。

3.一种如权利要求1、2所述建立的乳鹿分子身份证快速鉴定方法检及测试剂盒其特征在于，包括以下部分：

(1)如权利要求1所示的乳鹿分子身份证快速鉴定方法；

(2)如权利要求2所示的乳鹿分子身份证快速检测试剂盒。