[发明专利]一种检测LRRK2基因419多态性的引物和探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测LRRK2基因419位点多态性的引物和探针及试剂盒。利用1对LRRK2基因419位点特异性引物，扩增人类LRRK2基因419位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本发明在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

技术领域

本发明涉及一种检测LRRK2基因419多态性的引物和探针及试剂盒，属于基因多态性检测技术领域。

背景技术

帕金森病(PD)是除了阿尔茨海默病(AD)以外的第二常见的神经退行性疾病。在我国65岁以上人群的患病率为1700/10万，并随年龄增长而升高，给家庭和社会带来沉重的负担。该病的主要病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元丢失和路易小体形成，其主要生化改变为纹状体区多巴胺递质降低，临床症状包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势平衡障碍的运动症状及嗅觉减退、快动眼期睡眠行为异常、便秘和抑郁等非运动症状。帕金森病的发病率随年龄增长而增加，10％-20％的患者有家族史。随着对帕金森病发病机制的研究，提示遗传因素在帕金森病发病中有着不容忽视的作用。现已发现与帕金森病明确有关的致病基因有7个，而LRRK2基因突变是常染色体显性遗传最常见的原因，并且最有可能在典型晚期发病的帕金森病中起作用。

LRRK2基因又称PARK8基因，位于12号染色体11.2-13.1，全长约144kb，含有51个外显子。其遗传方式属于常染色体显性遗传，编码含2527个氨基酸，分子量为280kDa的蛋白，又称为dardarin蛋白或富亮氨酸重复序列激酶，属于表面膜蛋白家族。

LRRK2基因结构复杂，功能多样，其突变率也较高，首次发现LRRK2基因突变源于一个日本家系，其表现为迟发型帕金森显性遗传。约有1％-2％的散发性帕金森病人发生了LRRK2基因突变，7％左右的家族性帕金森病例也发现存在LRRK2基因突变。但是不同人种和地区帕金森病患者的致病基因并不相同。例如在欧洲人群中研究最为普遍的G2019R突变，在1％～4％的帕金森病病人中发现该基因突变，在葡萄牙人、犹太人和北非阿拉伯帕金森病病人中，G2019R的突变概率分别占6％、15％和40％。G2385R、R419P和A419V在东亚人群中更为常见，其中G2385R、R419P两个突变在亚洲帕金森病人群中占5-9％，并且这两个突变都增加了帕金森病2倍的风险。而A419V可提示亚洲人群早发型帕金森病的风险。

A419V位于LRRK2蛋白的Armadillo结构域，SIFT和polyphen2预测错义突变的蛋白功能，其在脊椎动物中保守，提示A419V可能对LRRK2有重要影响。

基于亚洲人的研究表明，A419V会增加患帕金森病的风险大约2倍，可能在早发性PD患者中起主要作用。A419V(rs34594498)在白种人PD患者和对照组中频率较小(Ross etal.，2011)，在基于白种人的外显子组数据库中，A419V的等位基因频率(MAF)＜0.001(http://exac.broadinstitute.org)。然而，它在亚洲人口中出现的频率要高得多(0.01)(http://www.ensembl.org)，这可以假设它可能对亚洲人口产生更大的潜在影响。这也可能是解释A419V是亚洲特异性的一个可能的原因，就像一些其他的LRRK2变体，如G2385R,R419P(亚洲特异性)和G2019S(德系犹太人，北非阿拉伯人和高加索人特异性)。

现有技术存在如下缺陷和不足：

现有市面上无上市试剂盒对其进行检测；我们的试剂盒特异性筛选ARMS引物与MGB探针，特异性非常强，结果判读无需计算，清晰明确。