[发明专利]一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。所述重组大肠杆菌含有的重组质粒携带编码L‑色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列；所述L‑色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB。本发明中，L‑色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的组合在大肠杆菌中能够正常表达，并且能够以L‑色氨酸为底物高效合成CPA及抗癌药物中间体，为抗癌药物的筛选和研发提供了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法和应用，尤其涉及一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

癌症严重威胁人类健康，其诱发因素往往源于信号通路中激酶的异常活化。另外，自身免疫病、神经退行病等常见高发慢性病也与激酶异常密切相关。2001年，第一个激酶抑制剂类药物格列卫(Gleevec)在美获批上市，开启了癌症靶向治疗新时代，疗效显著优于化疗。截至2019年底，FDA共批准了52个激酶抑制剂。虽然数量较多，但由于癌症种类繁多、涉及的异常激酶众多且变异类型多样、以及使用后耐药等因素，癌症在临床上仍存在重大未满足的治疗需求。另外，这些上市药物仅靶向大约25个激酶，仅占人体518个激酶中的5％，尚有大量激酶暂未成药。因此，这类药物研发空间巨大。

抗肿瘤新药主要来源于天然产物类似物。因此，有效合成天然产物类似物的创新技术对于新药发现来说至关重要。天然产物往往结构复杂，含有多个手性中心。相对于化学合成，因具有严格的区域和立体选择性，生物合成更有优势。尤其是合成生物学原理与技术的日益成熟，使得天然产物类似物的有效合成易于实现。

双吲哚生物碱是一类含有两个吲哚基团的天然产物，代表化合物为具有抗肿瘤活性的星孢菌素(Staurosporine)和蝴蝶霉素(Rebeccamycin)。星孢菌素是一种来源于放线菌的天然产物，具有广谱强效的激酶抑制活性。据不完全统计，星孢菌素能够有效抑制200多种人体激酶，多个激酶的半抑制浓度(IC50)能够达到nM级别。蝴蝶霉素也是一种来源于放线菌的天然产物，具有强效的拓扑异构酶和激酶抑制活性。开发双吲哚生物碱类似物的有效合成技术，是促成这类化合物广泛成药的关键因素。

星孢菌素的生物合成基因簇DNA序列在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别。随后，多个天然合成酶如StaO、StaD、StaP、StaC等的催化活性在体外生化实验中得到证实，式I显示了星孢菌素的生物合成途径，其中R基团表示＝O或者＝NH，两者可逆。

蝴蝶霉素的生物合成基因簇DNA序列也在2002年被测定，天然合成酶系被初步识别，式II显示了蝴蝶霉素的生物合成途径，其中R基团表示＝O或者＝NH，两者可逆。

对比式I和式II可知，星孢菌素与蝴蝶霉素的生物合成途径极其相似，其中，StaO与RebO系同工酶，StaD与RebD系同工酶，StaP与RebP系同工酶，但StaC与RebC非同工酶，StaC催化K252c的合成，而RebC催化1,11-二氯-Arcyriaflavin A的合成。

基于已鉴定的星孢菌素和蝴蝶霉素的生物合成途径酶系，研究人员在异源宿主白色链霉菌(Streptomyces albus)体内实现了多个双吲哚生物碱类似物的生物合成，例如，以色氨酸为起始使用酶组合RebO，RebD，RebP和StaC实现了K252c的合成，以色氨酸为起始使用酶组合RebO，RebD，RebP和RebC实现了Arcyriaflavin A的合成，然而，上述组合均在白色链霉菌中表达，且产量均未知。

因此，提供一种合成星孢菌素和蝴蝶霉素中间体的生物合成路径和生产菌株对于提高星孢菌素和蝴蝶霉素的产量，以及对抗癌药物的筛选和研发而言具有重要的意义。

发明内容