[发明专利]一种合成抗癌药物中间体的重组大肠杆菌及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202110262205.7 | 申请日： | 2021-03-10 |
| 公开（公告）号： | CN112980864A | 公开（公告）日： | 2021-06-18 |
| 发明（设计）人： | 李永安;刁刘洋;周亚维;於四杰 | 申请（专利权）人： | 百缮药业（苏州）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/53;C12N15/60;C12N9/02;C12N9/06;C12N9/88;C12N1/21;C12P17/18;C12P17/16;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 巩克栋 |
| 地址： | 215000 江苏省苏州市苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 合成 抗癌 药物 中间体 重组 大肠杆菌 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列；
其中，所述L-色氨酸氧化酶为VioA，所述CPA合成酶为VioB。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述两种单加氧酶为RebP和SpcC的组合或RebP和RebC的组合；
优选地，所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、单加氧酶RebP和单加氧酶SpcC的核苷酸序列；或者，
所述重组质粒携带编码L-色氨酸氧化酶VioA、CPA合成酶VioB、单加氧酶RebP和单加氧酶RebC的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括大肠杆菌表达质粒；
优选地，所述大肠杆菌表达质粒包括pETDuet系列、pACYCDuet系列、pRSFDuet系列、pCOLADuet或pCDFDuet系列表达载体中的任意一种，进一步优选为pCDFDuet系列表达载体。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒上，编码L-色氨酸氧化酶的核苷酸序列和编码CPA合成酶的核苷酸序列相连，编码单加氧酶的核苷酸序列相连；
优选地，所述核苷酸序列之间通过核糖体结合位点相连。
5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包含如权利要求1～4任一项所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的抗癌药物中间体的产量不低于10μM；
优选地，所述抗癌药物中间体包括K252c和/或Arcyriaflavin A。
7.根据权利要求5或6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为含有所述重组质粒的商业化大肠杆菌和/或经人工改造的大肠杆菌；
优选地，所述重组大肠杆菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种如权利要求5～7任一项所述的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将如权利要求1～4任一项所述的重组质粒通过电转化或者化学转化的方法转入大肠杆菌，得到所述重组大肠杆菌。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒的构建方法包括：
将合成的编码L-色氨酸氧化酶、CPA合成酶和两种单加氧酶的核苷酸序列通过酶切、连接的方式插入大肠杆菌表达质粒，得到所述重组质粒；
优选地，所述酶切的方式为双酶切；
优选地，所述双酶切的位点组合包括酶切位点NcoI和BamHI的组合和/或酶切位点NdeI和XhoI的组合。
10.如权利要求1～4任一项所述的重组质粒或如权利要求5～7任一项所述的重组大肠杆菌在制备抗癌药物或抗癌药物中间体中的应用；
优选地，所述抗癌药物包括星孢菌素和/或蝴蝶霉素。
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