[发明专利]一种检测DNA羟化酶TET1的纳米传感器及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种纳米传感器在制备检测DNA羟化酶TET1活性的试剂盒中的应用，其特征是，一种检测DNA羟化酶TET1的试剂盒包括纳米传感器、尿苷二磷酸葡萄糖、缓冲溶液；所述检测DNA羟化酶TET1的纳米传感器包括发夹探针、T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶、内切酶、量子点；

所述发夹探针为能够形成茎环结构的单链DNA，所述发夹探针的一端连接荧光剂，另一端能够与量子点配合连接，形成茎环结构的茎区域含有被内切酶识别并剪切的位点，所述位点含有5-甲基胞嘧啶；

量子点与荧光剂能够配合发生荧光共振能量转移；

所述荧光剂为Cy5，所述量子点为605QD；所述内切酶为内切酶MspI；

发夹探针通过生物素-链霉亲和素与量子点连接；发夹探针连接生物素，量子点表面包被链霉亲和素；

发夹探针形成茎环结构后，能够连接量子点的一端突出；

发夹探针的序列为：

TTT TTC ACT C^mCG GTC ACG TTT TCG TGA CCG GAG TG，其中，^mC为甲基胞嘧啶。

2.一种DNA羟化酶TET1活性的检测方法，其特征是，提供权利要求1所述的检测DNA羟化酶TET1的纳米传感器；步骤如下：

TET1的测定：首先，检测探针与含有5mM MgCl₂、10mM Tris-HCl，且pH为8.0的缓冲液A在95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温；然后，在含有50mM HEPES、50mM NaCl、75μM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂、2mM抗坏血酸、2.5mM DTT和1mMα-KG的反应液中加入144nM检测探针和不同浓度的TET1，37℃反应30min；第三，反应产物与40μM尿苷二磷酸葡萄糖和3U T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶和含有50mM醋酸钾、20mM Tris-Ac、10mM醋酸镁、1mM DTT，且pH为7.9的缓冲液B组成反应溶液，37℃孵育2h；随后，糖基化产物与30U MspI和含有10mM醋酸镁、20mM Tris-Ac、50mM醋酸钾、0.1mg/mL BSA，且pH为7.9的缓冲液C组成反应溶液，37℃消化2h；最后，将消化后的产物加入0.5nM 605QDs和含有100mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、3mM MgCl₂，且pH为8.0的60μl缓冲液D中，室温孵育20min，得到605QD-DNA-Cy5纳米结构；

TET1测定的检测探针为5’-biotin-TTT TTC ACT C^mCG GTC ACG TTT TCG TGA CCG GAGTG-Cy5-3’，其中，^mC为甲基胞嘧啶；

凝胶电泳分析：MspI的消化产物与荧光指示剂混合加入12％的聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶放入三羟甲基氨基甲烷-硼酸中，在110V恒压室温条件下电泳40min；多通道成像由ChemiDoc MP成像系统完成。SYBR Gold信号使用460-490nm激发的Epi-blue和518-546nm滤光片进行测量，Cy5信号使用625-650nm激发的Epi-red和675-725nm滤光片进行测量；

荧光检测：荧光光谱由荧光分光光度计在488nm的激发波长下进行检测；

所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的。

3.一种权利要求1所述的试剂盒在筛选DNA羟化酶TET1药物中的应用，其特征是，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述DNA羟化酶TET1药物为TET1抑制剂。