[发明专利]一种创制高直链淀粉玉米种质的方法

说明书

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种创制高直链淀粉玉米种质的方法。本发明首先设计了用于创制高直链淀粉玉米种质的sgRNA，其包括：序列如SEQ ID NO.1所示的特异性靶向玉米ZmSBEIIb基因的sgRNA1；和/或，序列如SEQ ID NO.2所示的特异性靶向玉米ZmSSSIII基因的sgRNA2。本发明所提供的sgRNA和CRISPR/Cas9敲除载体可以显著提高玉米ZmSBEIIb和ZmSSSIII基因的敲除效率。同时，在按本发明中的方法创制高直链淀粉玉米种质后，可以显著提高玉米籽粒中的直链淀粉含量，有利于其在食品涂料和包装用薄膜领域中的推广应用。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种创制高直链淀粉玉米种质的方法。

背景技术

基因组编辑是一种对基因组进行定向精确修饰的技术，主要包括锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(TranscriptionActivator-Like Effector Nucleases，TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatednuclease，CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas系统大致分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3类，其中II型系统的组成比较简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA 3种成分即可发挥作用，且具有高效性和易操作性，成为目前应用最广泛的基因组编辑系统。II型CRISPR/Cas系统的特征蛋白为Cas9，Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个核酸酶结构域,该结构域负责切割靶DNA的两条链，从而造成靶DNA双链断裂。其中HNH结构域负责切割与crRNA互补的DNA链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif,PAM)上游3bp处，RuvC结构域则负责切割非互补链，切割位点位于PAM上游3-8bp处。Cas9蛋白同时具有加工产生crRNA以及切割外源核酸的功能。crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，研究者可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者将两者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)。sgRNA能够与Cas9核酸内切酶结合并将Cas9引导至基因组上对靶位点进行切割。CRISPR/Cas9系统使目标基因DNA产生双链断裂，激活细胞内的DNA损伤修复机制，进而产生缺失、敲入等变异。目前，CRISPR/Cas9系统已被迅速地用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得了较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。

玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学工业的原料，在我国农业生产和经济发展中占有重要地位。玉米籽粒的主要产出物是淀粉，不同玉米的品种其淀粉含量不同。根据轻工部颁布的淀粉玉米分级标准:一级为玉米籽粒中粗淀粉含量为75％以上，二级为72％以上，三级为69％以上。普通玉米淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合体,两者所占的比重分别大约为28％和72％。直链淀粉含量在50％以上的玉米通常称为高直链淀粉玉米。位于第5染色体上的ae1基因发生突变能够产生高直链淀粉玉米。ae1基因和能够修饰ae1基因的其他基因共同作用，能够使玉米籽粒中直链淀粉含量超过50％，而普通玉米籽粒中直链淀粉含量30％。高直链淀粉因其特殊的分子理化性质，其利用价值也不同。用直链淀粉可制造一种半透明纸，不透氧气和氮气，透二氧化碳和脂肪也很少，且这种纸可食用；自七十年代以来，这种纸已用作面包酶的包装，预期在食品工业中的用途会日益广泛。高直链羟丙基淀粉能溶于水，形成透明并可食用的薄膜，氧气不能渗入，在常温和不同相对湿度时都是如此，适于做食品涂料和包装用薄膜。目前，直链淀粉供不应求，其价格非常昂贵，如果通过进口成本也十分高。所以，创制高直链淀粉玉米新品种是玉米育种的重要目标，意义十分重要。

发明内容