[发明专利]一种牛源性成分的LAMP检测方法

说明书

本发明公开了一种牛源性成分的LAMP检测方法，包括以下步骤：a)设计合成引物；所述引物由上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1～4；b)制备牛属北美野牛、奶牛、牦牛、水牛的DNA稀释液；c)配制LAMP反应体系并设定反应条件；d)进行LAMP方法特异性检测；e)进行LAMP方法灵敏度检测。本发明建立的方法具有快速、高效、灵敏、准确等优点，在动物源性成分食品监管和检验检疫工作中有实际应用价值，尤其适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及动物源性成分特异性的检测方法，具体涉及LAMP方法检测牛源性成分的引物和方法。

背景技术

由于价格、宗教、健康等原因，许多国家要求肉类及其制品类的食品标签必须真实明确地标出肉类来源，禁止掺假行为，以保护消费者的利益，但是市场上混淆肉类品种的现象仍然非常普遍，主要是在高价肉类中掺杂低价肉类，如牛肉、羊肉中掺杂猪肉、鸭肉等。2013年，在瑞典、英国和法国部分牛肉制品中发现了马肉，德国也宣布发现疑似此类情况，引发了消费者强烈反感，欧盟要求所有成员国对加工牛肉制品开展DNA抽检，以消除对“马肉风波”的忧虑。因此建立快速、准确的食品动物源成分安全检测技术，能够为消费者利益和生命安全提供技术保障。

动物源性成分的鉴定方法主要包括蛋白质鉴定(放射免疫法、色谱法等)和分子生物学鉴定(PCR方法等)两大类。应用蛋白质鉴定方法时，当肉类经过切碎、蒸煮、熏烤等加工过程后，肉中蛋白质结构通常被破坏，物种特有的蛋白质或抗原决定部位也遭到破坏。所以，通过蛋白质鉴定方法鉴别肉类品种的可靠性较差。相比之下，检测DNA的鉴定方法更可靠，因为DNA在所有组织细胞中都一样，不用考虑DNA是从肌肉、脂肪还是其他组织中提取的。由于分子生物学鉴定中的PCR法反应时间短，具有较高的灵敏度、特异性和可操作性，目前已成为肉制品种属鉴别最常用的方法，但普通PCR法扩增后需要凝胶电泳进行结果分析，所用染液EB为强致癌物质，因此存在一定的操作安全隐患，并且还存在非特异性扩增导致的假阳性问题。常规的动物源性成分的检测主要采用普通PCR方法和TaqMan实时荧光定量PCR方法。普通PCR方法由于操作繁琐、耗时长、易污染环境等缺点已逐渐被TaqMan实时荧光定量PCR取代。TaqMan实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性好，但需昂贵的荧光PCR仪和配套的试剂，不能普遍适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本学者Notomi研发的基因诊断技术，该方法针对目的基因的6个区段设计引物，提高了检测的特异性，同时该方法的扩增效率较普通PCR高，很大程度地提高了灵敏度。因此可以应用该技术尝试实现多靶标的动物源性成分的现场快速检测，而不需要依赖额外复杂的实验设备及其他条件，有很大的实际应用前景。

LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点，现已应用于致病微生物、病毒、寄生虫的鉴定，转基因和动物源成分检测等多方面。目前对于这一技术的运用有对于微生物病原体的检验上，如大肠杆菌、沙门氏菌、分支杆菌、口蹄疫病毒等。Denschlag等人用该技术检测了致突镰刀菌的Hyd5，Qingchao Li等验证了应用LAMP技术转基因水稻中的cry1Ab基因优于qPCR方法，刘少宁等建立了一种能够快速区分出绵羊肉中掺入狐狸源性成分的环介导等温扩增方法，徐淑菲等根据羊cytB基因设计特异性引物，动物GenieⅡ等温扩增荧光检测系统，建立了检测羊源性成分的LAMP方法。目前关于动物源性成分LAMP检测技术的应用多数是针对单靶标检测的，且大部分方法是基于线粒体DNA靶序列的，而同一细胞中线粒体的拷贝数不定，该技术的高灵敏度可能会导致无论反应工作与否都得到阳性结果，因此有必要建立基于牛属共有基因组DNA序列的LAMP检测方法。

但是，目前依然尚无关于LAMP方法检测牛源性成分的报道或者专利。因此有必要建立对牛源性成分的LAMP检测技术。

发明内容