[发明专利]一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用

说明书

本发明公开了一种内切褐藻胶裂解酶、其编码基因及应用。本发明以弧菌Vibriosp.MCCC 1A13243的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增内切褐藻胶裂解酶基因,将该基因克隆入pET‑22b表达载体上，在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达，采用Ni‑Sepharose亲和层析纯化得到较高纯度的重组内切褐藻胶裂解酶蛋白。该酶的最适温度为35℃，最适pH为8.5，在0～65℃和pH 4.5～10.5范围内稳定性良好；Co²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Fe³⁺能够明显促进该酶活性；该酶对海藻酸钠降解作用最强，也能降解多聚古洛糖醛酸和多聚甘露糖醛酸，降解这三种底物的主要产物为二糖。该酶在生产褐藻寡糖尤其是褐藻二糖方面具有优势。

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段获得一种内切褐藻胶裂解酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

褐藻胶是一类主要从褐藻细胞壁中提取的水溶性酸性多糖，它是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体随机排列组成的多聚物，这两种单体通过1，4-糖苷键连接能形成三种不同形式的多糖片段：聚β-D-甘露糖醛酸(Polymannuronic acid，PolyM)片段、聚α-L-古罗糖醛酸(Polyguluronic acid，PolyG)片段以及二者杂合片段(PolyMG)。褐藻胶因其具有抗肿瘤、降血压等生理活性，被广泛应用于食品、医疗、农业、能源等方面。

目前生物酶法是降解褐藻胶的重要方法，相较于会污染环境、低效率、反应条件难以控制的化学和物理降解法，生物酶法具有反应条件温和可控、专一性强等优势。褐藻胶裂解酶可通过β-消除反应将褐藻胶降解为一系列不饱和糖醛酸寡糖和单体，这些降解产物具有促进植物生长、缓解植物胁迫、抗炎、抑菌、抗肿瘤及抗氧化等生理活性，因此，褐藻寡糖的生产极为重要。按照作用方式不同，褐藻胶裂解酶分为内切型和外切型两种。到目前为止，在CAZy(Carbohydrate-Active Enzymes)数据库中，褐藻胶裂解酶分属于12个多糖裂解酶家族(Polysaccharide Lyases，PLs)，包括PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36和PL39。

褐藻胶裂解酶来源广泛，目前在藻类、细菌、海洋软体动物、真菌和病毒中均有发现。微生物来源的褐藻胶裂解酶种类最为丰富，这些微生物包括弧菌属(Vibrio)，假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，微泡菌属(Microbulbifer)，黄杆菌属(Flavobacterium)，芽孢杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)等的成员。

随着基因组测序技术的发展，越来越多的褐藻胶裂解酶基因被注释出来，通过基因工程等手段对其进行功能研究，但目前发现的内切型褐藻胶裂解酶绝大多数作用温度范围较窄，对高温、酸碱和金属离子耐受性比较差，且降解产物为多种组分混合物从而干扰褐藻寡糖结构和功能的关联分析，在工业应用上受到很大的限制。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种内切褐藻胶裂解酶(命名为VAL3)。

该酶的最适温度为35℃，最适pH为8.5，在0～65℃和pH 4.5～10.5范围内稳定性良好；Co²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺和Fe³⁺能够明显促进该酶活性；该酶对海藻酸钠降解作用最强，也能降解多聚古洛糖醛酸和多聚甘露糖醛酸，降解这三种底物的主要产物为二糖。

编码该酶的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO:1)

其中，5’端57bp片段为编码信号肽序列。该酶的氨基酸序列如下：(SEQ ID NO:2)