[发明专利]一种构建酿酒酵母人工小启动子文库的方法及应用

说明书

本发明公开了一种构建酿酒酵母人工小启动子文库的方法及应用。本发明提供了一种构建酿酒酵母人工启动子突变体文库的方法，包括：对酿酒酵母人工启动子UASF‑E‑C‑core1的核苷酸序列自3’末端起的第1‑6位中的全部或部分进行随机突变，得到酿酒酵母人工启动子突变体文库。本发明以Alper获得的最强的小合成启动子为支架，以绿色荧光蛋白(GFP)为报道基因，构建kozak文库。并将其应用于酿酒酵母内源途径的代谢调控中，使代谢途径中的基因匹配合适的表达量，避免有毒的中间代谢产物大量积累对细胞生长造成抑制或关键基因表达强度不足造成目标产物产量低等问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种构建酿酒酵母人工小启动子文库的方法及应用。

背景技术

随着合成生物学的发展，利用生长速度快、培养条件简单的微生物异源生产大宗化学品及高附加值产品成为可能。酿酒酵母作为目前被研究的最深入的单细胞低等真核生物，因其遗传操作简单、具有完善的发酵和工程技术，常被用作生产多种燃料、化学品、食品配料和药品的细胞工厂。自2013年Keasling团队成功在酿酒酵母中异源合成抗疟疾药物青蒿素的前体青蒿酸后，这种从发酵罐中“酿”出来的青蒿酸使人们实现了造物自由。自此之后，更多复杂的、高附加值的化合物的合成路径在酿酒酵母被打通，如人参皂苷、吗啡以及结构更为复杂的东莨菪碱等。然而，引入外源的合成途径往往会打破细胞内的代谢平衡，进而影响目标代谢产物的合成。因此，如何协调代谢途径中各个基因的表达，已经成为合成生物学研究的一个重要内容。

研究者开发了一系列控制元件来调控代谢途径中基因的表达强度，如启动子元件、终止子元件及3’UTRs等。大肠杆菌也常用RBS(ribosome bind site)文库调控途径中的基因表达。RBS是原核生物起始密码子AUG上游的一段非翻译区，其中包含一段SD(Shine-Dalg-arno)序列，长度约5个核苷酸，负责与核糖体16SrRNA的3'端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。真核生物的Kozak区与原核生物的SD序列发挥着类似的功能，是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后的一段核酸序列，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始，通过核糖体扫描并识别起始密码子影响翻译起始速率。Kozak区的长度和核苷酸组成在不同物种中有所差异，一个或多个点突变会影响基因的表达。虽然Kozak区影响基因表达的机制已经被解析，但对Kozak区建库调控途径基因表达的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建酿酒酵母人工小启动子文库的方法及应用。

第一方面，本发明要求保护一种构建酿酒酵母人工启动子突变体文库的方法。

本发明要求保护的构建酿酒酵母人工启动子突变体文库的方法，可包括如下步骤：对酿酒酵母人工启动子UASF-E-C-core1的核苷酸序列自3’末端起的第1-6位中的全部或部分进行随机突变，得到酿酒酵母人工启动子突变体文库。

其中，所述酿酒酵母人工启动子UASF-E-C-core1的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第29-153位所示。

在本发明的具体实施方式中，具体是通过PCR的方式对所述酿酒酵母人工启动子UASF-E-C-core1的核苷酸序列(SEQ ID No.4的第29-153位)自3’末端起的第1-6位中的全部进行随机突变的，引物中对应于所述酿酒酵母人工启动子UASF-E-C-core1的核苷酸序列(SEQ ID No.4的第29-153位)自3’末端起的第1-6位处为NNNNNN，N为A或T或C或G。

第二方面，本发明要求保护用于筛选目的酿酒酵母人工启动子突变体的重组载体库。