[发明专利]一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物

说明书

本发明提供了一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明根据NCBI(National Center for Biotechnology Information）数据库禽源多杀性巴氏杆菌中kmt1基因（Genbank:AF16259）、编码荚膜A型（capA）(Genbank:AF067175)和编码脂多糖（LPS1）基因簇等的保守序列进行引物设计，于国内外率先建立禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型（A型和L1型）鉴定的多重PCR引物，该方法灵敏度高、特异性强，最低可检测116pg的核酸。

技术领域

本发明涉及一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物，属于兽医传染病学领域。

背景技术

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multicida ）属于革兰氏阴性杆菌，是一类重要的、能感染多种宿主的病原菌，可导致禽霍乱，猪萎缩性鼻炎，还可以导致牛、羊以及家兔等动物发生出血性败血病。该类细菌流行于全球，给各地的养殖业造成了不可估量的经济损失。禽源多杀性巴氏杆菌可感染各品种水禽，30日龄以上特别是产蛋水禽更易感。急性发作时病程短促，死亡率高，病变特征为心冠脂肪出血、肝脏灰白色点状坏死和肠道出血等。慢性发作时，以慢性呼吸道炎、慢性胃肠炎、肉髯水肿和关节炎等多见。禽霍乱已成为危害水禽养殖业的重要传染病之一。

多杀性巴氏杆菌血清型众多，按照荚膜抗原的不同可以被分为 A、B、D、E、F 五种血清型；按照脂多糖抗原的不同可以被分为 16 种血清型（1-16）。五种荚膜血清型和 16种脂多糖血清型又被分别划分为五种荚膜基因型（A、B、D、E、F）和 8 种脂多糖基因型（L1-L8）。目前，根据我们团队前期的研究结合参考文献确定禽源多杀性巴氏杆菌的优势荚膜型为A型，优势脂多糖型为L1型，然而在实际工作中需要做三个PCR才能分别鉴定出多杀性巴氏杆菌、荚膜血清型和脂多糖血清型，费时费力且浪费耗材，鉴于此，本发明建立快速、简便、敏感、特异的禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR方法，旨在快速检测临床的疑似病例，还可用于血清型的鉴定，对于禽霍乱的分子流行病学调查具有重要的科学意义和应用价值。该多重PCR鉴定方法的建立对于禽霍乱的有效防控提供技术支撑，具有重大的现实意义。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR引物，所述引物序列如下：

所述三组引物根据kmt1基因、编码荚膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇的保守序列来设计合适大小的片段，分别用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型的鉴定。该引物组合不仅能准确地鉴定禽源多杀性巴氏杆菌，同时还能鉴定出它的血清型。

所述3组引物主要用来鉴定禽源多杀性巴氏杆菌和血清型。第一组引物所扩增的产物为编码脂肪酶的基因，片段大小为230 bp；第二组引物所扩增的产物为编码荚膜A型的基因，片段大小为529 bp；第三组引物所扩增的产物为编码脂多糖LPS1型的基因，片段大小为763bp。

利用本发明的引物对PCR进行反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于禽源多杀性巴氏杆菌及其血清型鉴定的多重PCR方法。

具体操作方法如下：

1、引物设计

参考NCBI 数据库中kmt1基因、编码荚膜A型（capA）和脂多糖（LPS1）基因簇的保守序列，利用Lasergene v 7.1 DNAStar软件进行同源性分析比较，利用Oligo 7.0软件，分别在保守区设计引物，并采用BLAST工具进行检索，验证其特异性。

2、反应体系的优化