[发明专利]催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法

说明书

本发明涉及一种催化长侧链芳香族胺与2‑酮丁酸合成L‑2‑氨基丁酸的方法，本发明采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ω‑转氨酶作为催化剂催化长侧链芳香族胺与2‑酮丁酸合成L‑2‑氨基丁酸。本发明筛选得到的ω‑转氨酶，用于制备L‑2‑氨基丁酸，该ω‑转氨酶ppTA在利用无论是芳香族胺—苄胺，还是长侧链芳香族胺‑‑S‑苯基丁胺，在合成L‑2‑氨基丁酸方面有巨大潜力，在生物医药领域有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法。

背景技术

手性胺化合物是一类重要的医药中间体，具有较高的科研和开发价值。手性胺L-2-氨基丁酸作为非天然氨基酸，是医药领域多种具有价值的化合物的手性前体，包括抗惊厥药物布瓦西坦和左乙拉西坦，以及用于结核病治疗的乙胺丁醇等。合成L-2-氨基丁酸的方法有很多，化学法反应条件苛刻、成本高昂、路线复杂。生物法进行催化合成或拆分相对于上述化学法具有明显优势，绿色环保，底物廉价，反应温和，选择性高。

ω-转氨酶(ω-transaminase，EC 2.6.1.X)是一类5’-磷酸吡哆醛依赖性酶，能介导酮的不对称还原胺化或手性胺动力学拆分。该酶相对于胺氧化还原酶，具有选择性高，无需辅因子，高芳香族胺活性的优点。最早的转氨酶于上个世纪中旬被发现，直至上世纪末在手性体研究方面出现了重大的进展，如今ω-转氨酶在不对称合成手性胺方面研究发挥了重要作用。该酶最早在河流弧菌中发现并筛选而来，后逐渐被发现存在人苍白杆菌、节杆菌、紫色杆菌中等，并且研究充分且具有代表性。

非杆菌来源的ω-转氨酶报道较少，并且活性与应用远不如杆菌来源的酶。但是杆菌来源ω-转氨酶具有强烈底物抑制，以及底物适用性低，尤其涉及大于两个C的长侧链底物时毫无活性。

发明内容

为解决上述问题，本发明利用基因挖掘的便利性，找到非杆菌来源的酶活高，稳定性强，底物耐受性好的ω-转氨酶，并用于制备L-2-氨基丁酸，在利用无论是芳香族胺—苄胺，还是长侧链芳香族胺--S-苯基丁胺，在合成L-2-氨基丁酸方面有巨大潜力，在生物医药领域有较大的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种催化芳香族长链胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法，包括采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ω-转氨酶作为催化剂催化芳香族长链胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸。

进一步地，编码所述的ω-转氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，催化反应的体系包括：1～5U/mL的ω-转氨酶、5～15mM芳香族长链胺与5～15mM 2-酮丁酸。

进一步地，催化反应的条件是在25～40℃、pH 7～8条件下搅拌反应。

进一步地，催化反应通过加酸进行终止反应。

进一步地，所述的ω-转氨酶通过如下方法进行制备：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ω-转氨酶编码基因与质粒连接后转入宿主菌中，得到表达ω-转氨酶的重组菌；

(2)采用步骤(1)构建的重组菌诱导发酵生产得到含有ω-转氨酶的发酵粗酶液；

(3)将步骤(2)的发酵粗酶液进行纯化得到ω-转氨酶。

进一步地，所述的宿主菌为大肠杆菌。

进一步地，所述的质粒为pET28a(+)。

进一步地，所述的诱导发酵是在发酵至OD为0.5～0.7时，加入IPTG在15～18℃进行低温诱导产酶。

进一步地，所述的纯化包括采用镍离子亲和层析柱上样，咪唑作为流动相进行梯度洗脱；洗脱液经G25脱盐柱脱盐后超滤浓缩。