[发明专利]一种慢病毒滴度检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种慢病毒滴度检测引物、试剂盒及检测方法，该检测试剂盒含有SIN载体上特异性扩增引物，该引物仅能够检测出整合到宿主基因组中的慢病毒基因组拷贝数，从而消除了残留质粒DNA的干扰，最终建立了一种高效、准确、重复性好的慢病毒功能滴度测定方法，准确地确认慢病毒载体的整合拷贝数。

技术领域

本发明涉及病毒分子生物学领域，具体为一种慢病毒滴度检测引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

慢病毒载体是一种来源于I型人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiencyvirus,HIV)的逆转录病毒载体，具有宿主范围广、免疫原性低、转染效率高、目的基因稳定高效表达、可感染分裂和非分裂细胞等优点，已被广泛应用于基础研究和临床基因治疗中。慢病毒在宿主基因组中的随机整合可诱发整合位点附近基因表达上调，甚至激活原癌基因，导致肿瘤的发生。为了解决这个潜在的安全问题，目前已开发出第三代自失活(SIN)慢病毒载体系统，与第二代慢病毒载体相比，SIN载体具有以下特点：1)缺失5’LTR及3’LTR中具有启动子/增强子活性的U3区，并将5’LTR的U3区替换为RSV启动子，以补偿其转录活性；2)删除病毒复制所必需的tat基因；3)将rev基因在单独的载体上表达。这不仅进一步提高了慢病毒的生物安全性，降低了复制型慢病毒(RCL)产生的可能性，而且大大扩展了慢病毒载体在基因治疗领域的应用范围。基于慢病毒载体的基因治疗已成为当前多种遗传性疾病的理想选择，第一种基于慢病毒载体的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法tisagenlecleucel已于2017年8月获得FDA批准，用于治疗儿童和成人急性淋巴细胞白血病。慢病毒载体作为一种基因治疗载体，已越来越受到研究者的追捧。

获得准确的慢病毒滴度是实现精确给药剂量和保障患者安全的前提条件，因此，如何精确测定慢病毒滴度便显得至关重要。目前，慢病毒滴度测定的方法主要有三种，分别是ELISA法检测衣壳蛋白p24、RT-qPCR检测慢病毒基因组拷贝数和qPCR检测慢病毒功能滴度。其中，ELISA法通过测定p24蛋白的量来确定病毒颗粒的数量，检测所得到的滴度数据不仅包括了预期的具有感染活性的慢病毒颗粒，还囊括了游离的p24蛋白及基因组缺陷病毒，因此，采用ELISA法所测得的病毒滴度往往远高于实际的病毒滴度。RT-qPCR法通过将慢病毒RNA基因组逆转录成cDNA，然后以之为模板qPCR检测慢病毒基因组cDNA的拷贝数。与ELISA法相比，RT-qPCR法虽然避免了空壳病毒对滴度检测的干扰，但基因组缺陷病毒的存在仍对滴度检测结果造成了巨大影响，比实际病毒滴度高达20倍之多，且不同组间的波动幅度非常大。qPCR法则是以病毒转导细胞后提取的细胞基因组为模板进行qPCR，所得数据能够直观体现病毒基因组整合到宿主基因组中的拷贝数，与上述两种方法相比，qPCR法更能够体现慢病毒的实际功能滴度。

目前，qPCR法检测慢病毒滴度所涉及的上下游引物设计策略主要有三种：1)上下游引物设计在gag、env等两个LTR之间的病毒特异性序列上；2)上游引物设计在U5区，下游引物设计在病毒特异性序列上；3)上游引物设计在R区，下游引物设计在U5区。在慢病毒的纯化过程中，为了去除残留的质粒DNA污染，往往会在病毒液中加入DNase I或benzonase进行消化。在无慢病毒质粒DNA污染的情况下，上述三种引物都能够准确测定出慢病毒转导后在基因组中的拷贝数，即得到慢病毒的准确功能滴度。然而，即便在病毒纯化过程中加入了DNase I或benzonase以消化残留的质粒DNA，少量的DNA残留仍不可避免，此时用上述引物来检测病毒滴度显然是不合适的。现有的基于qPCR的慢病毒功能滴度测定方法的引物设计在慢病毒骨架上，当转导细胞的病毒中含有病毒质粒DNA残留时，该方法检测出来的拷贝数是残留质粒DNA拷贝数与病毒整合拷贝数之和，并不能准确反映慢病毒的真实功能滴度和整合拷贝数。

发明内容

本发明的第一个目的在于，为了消除残留质粒DNA的影响，提供一种引物。

本发明的第二个目的在于提供一种试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种慢病毒滴度检测方法。